Verbetering van de reproduceerbaarheid om te voldoen aan minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes 2018 Richtlijnen voor het volgen van nanodeeltjes

Summary

Nanoparticle tracking analysis (NTA) is een veelgebruikte methode om extracellulaire blaasjes te karakteriseren. Dit artikel belicht NTA experimentele parameters en controles plus een uniforme methode voor analyse en karakterisering van monsters en verdunningsmiddelen die nodig zijn om de richtlijnen van MISEV2018 en EV-TRACK voor reproduceerbaarheid tussen laboratoria aan te vullen.

Abstract

Nanoparticle tracking analysis (NTA) is sinds 2006 een van de vele karakteriseringsmethoden die worden gebruikt voor onderzoek naar extracellulaire blaasjes (EV). Velen zijn van mening dat NTA-instrumenten en hun softwarepakketten gemakkelijk kunnen worden gebruikt na minimale training en dat kalibratie van de grootte intern haalbaar is. Aangezien zowel NTA-acquisitie als software-analyse EV-karakterisering vormen, worden ze behandeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Bovendien zijn ze gemonitord door Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) om de robuustheid van EV-experimenten te verbeteren (bijvoorbeeld experimentele variatie als gevolg van ongecontroleerde factoren minimaliseren).

Ondanks inspanningen om de rapportage van methoden en controles aan te moedigen, rapporteren veel gepubliceerde onderzoeksdocumenten geen kritieke instellingen die nodig zijn om de oorspronkelijke NTA-waarnemingen te reproduceren. Weinig artikelen melden de NTA-karakterisering van negatieve controles of verdunningsmiddelen, kennelijk ervan uitgaande dat commercieel verkrijgbare producten, zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing of ultrapuur gedestilleerd water, deeltjesvrij zijn. Evenzo worden positieve controles of groottenormen zelden gerapporteerd door onderzoekers om de deeltjesgrootte te verifiëren. De Stokes-Einstein-vergelijking bevat monsterviscositeit en temperatuurvariabelen om deeltjesverplaatsing te bepalen. Het rapporteren van de stabiele temperatuur van de laserkamer tijdens de gehele monstervideoverzameling is daarom een essentiële controlemaatregel voor nauwkeurige replicatie. De filtratie van monsters of verdunningsmiddelen wordt ook niet routinematig gerapporteerd, en als dat zo is, worden de specifieke kenmerken van het filter (fabrikant, membraanmateriaal, poriegrootte) en opslagomstandigheden zelden opgenomen. De minimale normen van de International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) voor acceptabele experimentele details moeten een goed gedocumenteerd NTA-protocol bevatten voor de karakterisering van EV’s. Het volgende experiment levert bewijs dat een NTA-analyseprotocol moet worden vastgesteld door de individuele onderzoeker en moet worden opgenomen in de methoden van publicaties die NTA-karakterisering gebruiken als een van de opties om te voldoen aan de MISEV2018-vereisten voor karakterisering van één blaasje.

Introduction

Nauwkeurige en herhaalbare analyse van EV’s en andere deeltjes op nanometerschaal brengt tal van uitdagingen met zich mee in onderzoek en industrie. Replicatie van EV-onderzoek is moeilijk geweest, deels vanwege het gebrek aan uniformiteit in het rapporteren van noodzakelijke parameters in verband met gegevensverzameling. Om deze tekortkomingen aan te pakken, stelde de ISEV industrierichtlijnen voor als een minimale set biochemische, biofysische en functionele normen voor EV-onderzoekers en publiceerde deze als een positieverklaring, gewoonlijk MISEV2014¹ genoemd. Het versnellende tempo van EV-onderzoek vereiste een bijgewerkte richtlijn en de “MISEV2018: een positieverklaring van de ISEV” breidde de MISEV2014-richtlijnen^{uit 2}. Het MISEV2018-document bevatte tabellen, schetsen van voorgestelde protocollen en stappen die moeten worden gevolgd om specifieke EV-geassocieerde karakterisering te documenteren. Als een verdere maatregel om de interpretatie en replicatie van experimenten te vergemakkelijken, werd EV-TRACK ontwikkeld als een crowd-sourcing kennisbank (http://evtrack.org) om transparantere rapportage van EV-biologie en de methodologie die wordt gebruikt voor gepubliceerde resultaten^mogelijk te maken 3. Ondanks deze aanbevelingen voor gestandaardiseerde rapportage van methoden, blijft het veld lijden met betrekking tot het repliceren en bevestigen van gepubliceerde resultaten.

Passend bij de inspanningen van de National Institutes of Health en de National Science Foundation voor kwaliteitsbeoordelingsinstrumenten, suggereert dit artikel dat ISEV gestandaardiseerde rapportage van methoden en details vereist, zodat hulpmiddelen voor gegevensbeoordeling kunnen worden toegepast met als doel resultaten tussen laboratoria te repliceren. Het rapporteren van celbronnen, celkweekprocedures en EV-isolatiemethoden zijn belangrijke factoren om de kwaliteiten van de EV-populatie te definiëren. Onder NTA-instrumenten maken factoren zoals detectie-instellingen, de brekingsindex van dragervloeistof, heterogene deeltjespopulaties die bijdragen aan polydispersiteit, gebrek aan gestandaardiseerde rapportagevereisten en afwezige intra- en interwaarnemer meetresultaten NTA-vergelijking tussen laboratoria moeilijk of onmogelijk.

NTA is sinds 2006 in gebruik en is een populaire methode voor het bepalen van de grootte en concentratie van nanodeeltjes die momenteel door ongeveer 80% van de EV-onderzoekers wordt gebruikt⁴. De MISEV2018-richtlijnen vereisen twee vormen van analyse van één blaasje, waarvan NTA een van de populaire opties is. NTA wordt nog steeds algemeen gebruikt voor EV-karakterisering vanwege de brede toegankelijkheid, lage kosten per monster en de eenvoudige basistheorie (de Stokes-Einstein-vergelijking). EV-beoordeling door NTA genereert een deeltjesgrootteverdeling en concentratieschatting met behulp van laserlichtverstrooiing en Brownse bewegingsanalyse, waarbij de ondergrens van detectie wordt bepaald door de brekingsindex van de EV. Bij gebruik van een vloeistofmonster met bekende viscositeit en temperatuur worden de trajecten van de EV’s gevolgd om hun gemiddelde vierkante verplaatsing in twee dimensies te bepalen. Hierdoor kan de deeltjesdiffusiecoëfficiënt worden berekend en omgezet in een bolequivalente hydrodynamische diameter door een gemodificeerde Stokes-Einsteinvergelijking ^5,6,7. NTA’s deeltjes-naar-deeltjesanalyse heeft minder interferentie door agglomeraten of grotere deeltjes in een heterogene populatie van EV’s dan andere methoden van karakterisering⁷. Hoewel een paar grotere deeltjes een minimale impact hebben op de nauwkeurigheid van de maatvoering, resulteert de aanwezigheid van zelfs minieme hoeveelheden grote, hoge lichtverstrooiende deeltjes in een opmerkelijke vermindering van de detectie van kleinere deeltjes als gevolg van verminderde software EV-detectie en tracking⁸. Als meettechniek wordt NTA over het algemeen beschouwd als niet bevooroordeeld naar grotere deeltjes of aggregaten van deeltjes, maar kan het populaties van meerdere grootte oplossen door middel van individuele deeltjesanalyse⁹. Vanwege het gebruik van lichtverstrooiing door deeltjes, is een van de beperkingen van NTA-analyse dat deeltjes zoals stof, plastic of poeder met vergelijkbare brekings- en groottekenmerken in vergelijking met EV’s niet kunnen worden onderscheiden van werkelijke EV’s door deze methode van karakterisering.

De NanoSight LM10 (nanoparticle size analyzer) en LM14 (lasermodule) worden sinds 2006 verkocht, en hoewel er nieuwere modellen van dit instrument zijn ontwikkeld, is dit specifieke model te vinden in veel kernfaciliteiten en wordt het beschouwd als een betrouwbaar werkpaard. Training is nodig om de NTA-instellingen goed te optimaliseren voor metingen van grootte en concentratie met hoge resolutie. De twee belangrijke instellingen die nodig zijn voor optimale video-opnames zijn (1) het cameraniveau en (2) de detectiedrempel. Deze moeten door de exploitant worden ingesteld op basis van de kenmerken van het monster. Een van de belangrijkste beperkingen van de NTA-analyse is de aanbeveling van monsterconcentraties tussen 10⁷ en 10⁹ deeltjes / ml, om deze monsterverdunning te bereiken, kan¹⁰ nodig zijn. Oplossingen die worden gebruikt voor verdunning, zoals fosfaatbufferde zoutoplossing, zoutoplossing van 0,15 M of ultrapuur water, zijn zelden vrij van deeltjes kleiner dan 220 μm, wat van invloed kan zijn op de NTA-metingen. NTA-karakterisering van de oplossingen die worden gebruikt voor verdunning moet worden uitgevoerd op hetzelfde cameraniveau en dezelfde detectiedrempel als de nanodeeltjesmonsters die worden geanalyseerd. De grootte en concentratie van nanodeeltjes die aanwezig zijn in verdunningsmiddelen die worden gebruikt voor ev-monsterverdunningen worden zelden opgenomen in publicaties met betrekking tot NTA-analyse van EV’s.

Dit protocol maakt gebruik van NTA-analyse van synthetische EV-achtige liposomen geëvalueerd met behulp van geselecteerde cameraniveaus, detectiedrempels en mechanische filtering van de monsters om de systematische effecten van cameraniveau, detectiedrempel of monsterfiltratie op de NTA-dataset te analyseren. Liposomen werden gesynthetiseerd zoals beschreven in Supplemental File S1. Synthetische liposomen werden in dit experiment gebruikt vanwege hun grootte-uniformiteit, fysieke kenmerken en stabiliteit bij opslag bij 4 °C. Hoewel er gebruik had kunnen worden gemaakt van daadwerkelijke monsters van EV’s, kan de heterogeniciteit en stabiliteit van EV’s tijdens opslag deze studie en de interpretatie ervan hebben bemoeilijkt. Overeenkomsten in de NTA-rapporten van (A) liposomen en (B) EV’s geven aan dat de systematische effecten die in dit artikel voor liposomen worden onthuld, waarschijnlijk ook van toepassing zullen zijn op EV-karakterisering (figuur 1). Samen ondersteunen deze bevindingen het idee dat volledige rapportage van kritieke software-instellingen en de beschrijving van monsterverwerking, zoals verdunningsmiddel, verdunning en filtratie, van invloed zijn op de reproduceerbaarheid van NTA-gegevens.

Het doel van dit artikel is om aan te tonen dat het variëren van de NTA-instellingen (temperatuur, cameraniveau en detectiedrempel) en monstervoorbereiding de verzamelde resultaten verandert: systematische, significante verschillen in grootte en concentratie werden verkregen. Aangezien NTA een van de populaire opties is om te voldoen aan de MISEV2018-karakteriseringsspecificatie, tonen deze resultaten het belang aan van het rapporteren van monstervoorbereiding en NTA-instellingen om reproduceerbaarheid te garanderen.

Figuur 1: Representatieve NTA-rapporten om liposomen te vergelijken met EV’s. (A) Liposomen: ongefilterd monster gekarakteriseerd op NTA op 12 maart 2020. (B) EV’s: ongefilterd monster gekarakteriseerd op NTA op 26 augustus 2021. Afkortingen: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EV’s = extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Algemene protocolrichtlijnen Houd de microscoop op een luchttafel of op zijn minst op een trillingsvrije tafel. Zorg ervoor dat externe trillingen (bijv. voettikken op de vloer, aanraken van de tafel, deursluitingen, laboratoriumverkeer) tot een minimum worden beperkt. Stel de temperatuur van de lasermodule in en houd deze op een constante temperatuur voor alle video-opnames.OPMERKING: De gekozen temperatuur was 25 °C omdat de nanodeeltjesgrootteanalysator bij die temperatuur …

Representative Results

Tabel 1 bevat de resultaten van de NTA-video’s voor de liposoommonsters (18 gefilterd en 18 ongefilterd) en een representatief DPBS-verdunningsmiddel. Vergelijkingen tussen de twee groepen werden voltooid, ongeacht het cameraniveau of de detectiedrempel in dit artikel. Gefilterde monsters hadden een gemiddelde deeltjesdiameter van 108,5 nm, een deeltjesmodus van 86,2 nm en een concentratie van 7,4 × 108 deeltjes/ml. Ongefilterde monsters hadden daarentegen een gemiddelde deeltjesdiameter van …

Discussion

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de grootte en concentratie van nanodeeltjes te schatten¹¹. Deze omvatten ensemblemethoden die een schatting van de grootte van een populatie genereren, waaronder dynamische lichtverstrooiing (DLS), centrifugale sedimentatie en analyse-elektronenmicroscopie op één deeltjesniveau, NTA, atoomkrachtmicroscopie en instelbare resistieve pulsdetectie. Hiervan zijn DLS en NTA veel gebruikte, niet-destructieve maat- en concentratiemeetmethoden, gebaseerd op B…

Materials

Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container