مقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للورم الدبقي في خط الوسط المنتشر لدى الأطفال
Summary
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد المطبقة على خط خلايا الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط للأطفال ، وهو مفيد لدراسة التعبير عن البروتينات على غشاء البلازما في الوقت الفعلي أثناء العمليات الديناميكية مثل غزو الخلايا ثلاثية الأبعاد والهجرة.
Abstract
تعد هجرة الخلايا وغزوها من السمات المميزة للأورام الطافرة للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG) H3K27M. لقد قمنا بالفعل بنمذجة هذه الميزات باستخدام فحوصات الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد (3D). في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين هذه المقايسات 3D للكيمياء المناعية للخلايا الحية. تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة للكشف في الوقت الفعلي عن تعبير جزيء الالتصاق CD44 ، على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية لخط الخلايا الأساسي المشتق من المريض DMG H3K27M. يرتبط CD44 بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها ويشارك في التفاعلات المباشرة مع مصفوفة الجهاز العصبي المركزي (CNS) خارج الخلية. تم تضمين المجالات العصبية (NS) من خط خلية DMG H3K27M في مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) أو وضعها على طبقة طلاء رقيقة من BMM ، في وجود جسم مضاد ل CD44 بالتزامن مع كاشف وسم الأجسام المضادة (ALR). تم إجراء تحليل صورة الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد على أداة تحليل الخلايا الحية لقياس تعبير CD44 الكلي كميا ، وتحديدا على الخلايا المهاجرة والغازية. تسمح الطريقة أيضا بتصور التعبير المتقطع ل CD44 في الوقت الفعلي على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية. علاوة على ذلك ، قدم الفحص أيضا رؤى جديدة حول الدور المحتمل ل CD44 في انتقال اللحمة المتوسطة إلى الأميبات في خلايا DMG H3K27M.
Introduction
تعد قدرة الخلايا السرطانية على التهرب والانتشار عبر الأنسجة المحيطة سمة مميزة للسرطان1. على وجه الخصوص ، تعد حركة الخلايا السرطانية سمة مميزة للأورام الخبيثة ، سواء كانت نوعا من الورم النقيلي مثل الثدي2 أو سرطان القولون والمستقيم3 أو نوعا غازيا محليا مثل الورم الدبقيالمنتشر 4,5.
التصوير له دور مركزي في التحقيق في العديد من جوانب الأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، يفضل بالتأكيد تصوير الخلايا الحية عند دراسة العمليات الخلوية الديناميكية مثل الهجرة والغزو ، عندما تحدث تغييرات في التشكل والتفاعل بين الخليةوالخلية 6,7 ويمكن فحصها بسهولة أكبر بمرور الوقت. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية ، يمكن استخدام أنظمة مجهرية ضوئية مختلفة ، من تباين الطور إلى المجاهر الفلورية متحدة البؤر ، والحصول على الصور على مدى فترة زمنية قصيرة أو طويلة على مجهر مقلوب مجهز بغرفة للتحكم في درجة الحرارة و CO2 ، أو في أنظمة تحليل الصور عالية المحتوى التي تحتوي على غرف مدمجة ، أو بدلا من ذلك في أنظمة الصور التي يمكن أن تجلس في الحاضنة دون الحاجة إلى إزعاج الخلايا طوال المدة من التجربة. غالبا ما يتم تحديد اختيار النظام المستخدم من خلال عدد من العوامل مثل الدقة المطلوبة ، وطول وقت الاستحواذ الإجمالي والفترات الزمنية ، ونوع الوعاء المستخدم وإنتاجية الفحص (غرفة واحدة أو لوحة متعددة الآبار) ، وحساسية الخلايا المستخدمة (الخلايا الثمينة و / أو النادرة) والسمية الضوئية للخلايا في حالة وجود الفلوروفورات.
فيما يتعلق بالتصوير الفلوري في الوضع المباشر ، يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحويل الخلايا للتعبير عن البروتينات الفلورية إما للتعبير المستقر أو كنظام محفز8 ، عن طريق نقل الخلايا العابرة ، أو باستخدام أصباغ الخلايا المتاحة الآن لوضع العلامات على الخلاياالحية 7 ، لتتبع الخلايا الحية وكذلك لوضع العلامات على العضيات تحت الخلوية9.
تم تطوير نهج مفيد مؤخرا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ، حيث يمكن ربط الجسم المضاد الذي يتعرف على علامة السطح المفضلة بكاشف وضع العلامات ، وعند إضافة وسائط الثقافة ، يمكن تصوير الخلايا التي تعبر عن العلامة المحددة بسهولة في الوقت الفعلي عن طريق تصوير الخلايا الحية. يمكن تحقيق التصور والقياس الكمي لتعبير العلامة باستخدام مثل هذا النظام بسهولة عندما تنمو الخلايا في ظروف ثقافة ثنائية الأبعاد (2D)10.
في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين بروتوكولات غزو الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد وهجرة الخلايا المشتقة من المريض للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG)لدى الأطفال 11,12. DMG هي أورام دماغية شديدة العدوانية تؤثر على الأطفال ، بالنسبة للغالبية العظمى المرتبطة بطفرة المحرك K27M في متغيرات هيستون H3. تنشأ DMG في جذع الدماغ ومناطق خط الوسط في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتتميز بطبيعة تسلل للغاية. وقد ثبت أن هذه القدرة الغازية تتوسط جزئيا على الأقل عدم التجانس داخل الورم والسمات الشبيهة بجذع السرطان لخلايا DMG7.
لتوضيح مقايساتنا ، تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة (ALR) مع جسم مضاد ل CD44. CD44 هو بروتين سكري عبر الغشاء وجزيء الالتصاق يتم التعبير عنه على الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الأخرى ، المرتبطة بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها13. تشمل البروتوكولات إعداد العينة ، والحصول على الصور في وضع برايت فيلد وفلورسنت ، والتحليل على أداة تحليل الخلايا الحية التي سمحت بالقياس الكمي في الوقت الفعلي للتعبير الكلي CD44 على غشاء خلية DMG أثناء الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد. سمحت المقايسات أيضا بإمكانية تصور إشارة الفلورسنت المتقطعة ل CD44 على الخلايا الفردية أثناء الهجرة والغزو. ومن المثير للاهتمام أنه لوحظ أيضا تأثير الجسم المضاد ل CD44 ، والذي يحتمل أن يكون بمثابة جسم مضاد مانع ، ويبدو أيضا أنه يقلل من هجرة الخلايا وغزوها بالإضافة إلى إحداث تحول في نمط الغزو من نمط ظاهري جماعي يشبه اللحمة المتوسطة إلى نمط ظاهري شبيه بالأميبويد أحادي الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تكييف الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D التي اعتمدناها هنا لغزو DMG للأطفال والهجرة بسهولة أيضا لأنواع الخلايا السرطانية الأخرى شديدة التوغل ، بما في ذلك خطوط خلايا سرطان الثدي والقولون.
تختلف عن فحوصات الكيمياء المناعية للخلايا الحية2D التي تم إجراؤها سابقا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتورة سيلفيا سودو والدكتورة جوليا فيديريتشي (وحدة الشبكات الخلوية والأهداف العلاجية الجزيئية ، معهد IRCCS-Regina Elena الوطني للسرطان ، روما ، إيطاليا) للوصول إلى نظام تصوير الخلايا الحية IncuCyte S3 في الإعداد الأولي لبروتوكول التصوير. علاوة على ذلك ، نشكر برناديت كولوزفاري على المشورة الفنية. تم دعم الدراسة من قبل منحة الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة (16-234) ووزارة الصحة الإيطالية Ricerca Corrente. إم فينشي هو زميل الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة. حصل R Ferretti على زمالة Fondazione Veronesi (2018 و 2019). يعترف المؤلفون بمؤسسة الشفاء لدعمها ومؤسسة مستشفى الأطفال لتمويل بنك أورام الأطفال في كوينزلاند.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
Referencias
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
