Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique
Summary
Cette étude présente un protocole d’immunocytochimie de cellules 3D vivantes appliqué à une lignée cellulaire de gliome diffus pédiatrique, utile pour étudier en temps réel l’expression des protéines sur la membrane plasmique au cours de processus dynamiques tels que l’invasion et la migration des cellules 3D.
Abstract
La migration et l’invasion cellulaires sont des caractéristiques spécifiques des tumeurs mutantes H3K27M du gliome médian diffus (DMG). Nous avons déjà modélisé ces caractéristiques à l’aide de tests tridimensionnels (3D) d’invasion et de migration cellulaires. Dans cette étude, nous avons optimisé ces tests 3D pour l’immunocytochimie des cellules vivantes. Un réactif de marquage des anticorps a été utilisé pour détecter en temps réel l’expression de la molécule d’adhésion CD44, sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes d’une lignée cellulaire primaire dérivée du patient DMG H3K27M. CD44 est associé au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales et est impliqué dans les interactions directes avec la matrice extracellulaire du système nerveux central (SNC). Les neurosphères (NS) de la lignée cellulaire DMG H3K27M ont été intégrées dans la matrice de la membrane basale (BMM) ou placées sur une fine couche de revêtement de BMM, en présence d’un anticorps anti-CD44 en conjonction avec le réactif de marquage des anticorps (ALR). L’analyse d’images immunocytochimiques de cellules vivantes en 3D a été réalisée sur un instrument d’analyse de cellules vivantes pour mesurer quantitativement l’expression globale de CD44, en particulier sur les cellules migratrices et envahissantes. La méthode permet également de visualiser en temps réel l’expression intermittente de CD44 sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes. De plus, le test a également fourni de nouvelles informations sur le rôle potentiel de CD44 dans la transition mésenchymateuse vers amiboïde dans les cellules DMG H3K27M.
Introduction
La capacité des cellules tumorales à s’échapper et à se disséminer à travers les tissus environnants est une caractéristique du cancer1. En particulier, la motilité des cellules tumorales est une caractéristique des tumeurs malignes, qu’il s’agisse d’un type de tumeur métastatique tel que le cancer du sein2 ou colorectal3 ou d’un type localement invasif tel que le gliome diffus 4,5.
L’imagerie joue un rôle central dans l’étude de nombreux aspects des phénotypes de cellules tumorales; Cependant, l’imagerie de cellules vivantes est certainement à privilégier lors de l’étude de processus cellulaires dynamiques tels que la migration et l’invasion, lorsque des changements de morphologie et d’interaction cellule-cellule 6,7 se produisent et peuvent être examinés plus facilement au fil du temps. Pour l’imagerie de cellules vivantes, différents systèmes de microscopie optique peuvent être utilisés, du contraste de phase aux microscopes confocaux fluorescents, et l’acquisition d’images effectuée sur une courte ou longue période de temps sur un microscope inversé équipé d’une chambre pour le contrôle de la température et du CO2, ou dans des systèmes d’analyse d’images à haut contenu qui ont des chambres intégrées, ou bien dans des systèmes d’image qui peuvent rester dans l’incubateur sans avoir besoin de déranger les cellules pendant toute la durée de l’expérience. Le choix du système utilisé est souvent dicté par un certain nombre de facteurs tels que la résolution nécessaire, la durée du temps global d’acquisition et les intervalles de temps, le type de récipient utilisé et le débit du test (chambre unique ou plaque multipuits), la sensibilité des cellules utilisées (cellules précieuses et/ou rares) et la phototoxicité des cellules en présence de fluorophores.
En ce qui concerne l’imagerie fluorescente en mode vivant, cela peut être réalisé en transduisant des cellules pour l’expression de protéines fluorescentes soit pour une expression stable, soit en tant que système inductible8, par transfection cellulaire transitoire, soit en utilisant des colorants cellulaires qui sont maintenant disponibles pour le marquage des cellules vivantes7, pour le suivi des cellules vivantes ainsi que pour le marquage des organites subcellulaires9.
Une approche utile a récemment été développée pour l’immunocytochimie des cellules vivantes, où un anticorps reconnaissant un marqueur de surface de choix peut être lié à un réactif de marquage et, lors de l’ajout au milieu de culture, les cellules exprimant le marqueur spécifique peuvent être facilement imagées en temps réel par imagerie de cellules vivantes. La visualisation et la quantification de l’expression des marqueurs à l’aide d’un tel système peuvent être facilement réalisées lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de culture bidimensionnelles (2D)10.
Dans cette étude, nous avons optimisé les protocoles pour l’invasion immunocytochimique des cellules 3D vivantes et la migration des cellules pédiatriques de gliome diffus à ligne médiane (DMG) dérivées de patients11,12. Les DMG sont des tumeurs cérébrales très agressives affectant les enfants, pour la grande majorité associées à la mutation conductrice K27M dans les variantes de l’histone H3. Les DMG apparaissent dans le tronc cérébral et les régions médianes du système nerveux central (SNC) et se caractérisent par une nature hautement infiltrante. Il a été démontré que cette capacité invasive est au moins en partie médiée par l’hétérogénéité intratumorale et les caractéristiques cancéreuses des cellules DMG7.
Pour illustrer nos essais, un réactif de marquage d’anticorps (ALR) a été utilisé en combinaison avec un anticorps contre CD44. CD44 est une glycoprotéine transmembranaire et une molécule d’adhésion exprimée sur les cellules souches et d’autres types de cellules, associée au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales13. Les protocoles comprennent la préparation de l’échantillon, l’acquisition d’images en mode fond clair et fluorescent, et l’analyse sur un instrument d’analyse de cellules vivantes qui a permis de mesurer quantitativement en temps réel l’expression globale de CD44 sur la membrane cellulaire DMG pendant l’invasion et la migration 3D. Les tests ont également permis de visualiser le signal fluorescent intermittent de CD44 sur des cellules individuelles lors de la migration et de l’invasion. Il est intéressant de noter qu’un effet de l’anticorps anti-CD44 a également été observé, qui potentiellement agissant comme un anticorps bloquant, semblait également réduire la migration et l’invasion cellulaires ainsi qu’induire un changement du modèle d’invasion d’un phénotype mésenchymateux collectif à un phénotype amiboïde plus unicellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’immunocytochimie des cellules 3D vivantes que nous avons adoptée ici pour l’invasion et la migration pédiatriques de DMG pourrait être facilement adaptée également à d’autres types de cellules tumorales hautement invasives, y compris les lignées cellulaires cancéreuses du sein et du côlon.
Contrairement aux tests d’immunocytochimie sur cellules 2D vivantes10 précédemment réalisés, lorsque vous travaillez en 3D, il est suggéré de prêter attenti…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la Dre Silvia Soddu et la Dre Giulia Federici (Unité des réseaux cellulaires et des cibles thérapeutiques moléculaires, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italie) pour leur accès au système d’imagerie des cellules vivantes IncuCyte S3 dans la mise en place préliminaire du protocole d’imagerie. De plus, nous remercions Bernadett Kolozsvari pour ses conseils techniques. L’étude a été financée par la subvention Children with Cancer UK (16-234) et le ministère italien de la Santé, Ricerca Corrente. M Vinci est membre de Children with Cancer UK. R Ferretti est récipiendaire de la bourse de la Fondazione Veronesi (2018 et 2019). Les auteurs remercient la Fondazione Heal pour son soutien et la Children’s Hospital Foundation pour le financement de la Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
Referencias
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
