元ウテロ マウス胚の採虫前から高度器官形成までの培養
Summary
全胚培養のための強化されたプラットフォームは、着床後マウス胚の連続的かつ堅牢な 子宮外 発生を、胃支前段階から高度な器官形成まで、最大6日間可能にする。このプロトコルでは、静的プレートと回転ボトルシステムを使用して胚培養を成功させるための標準的な手順を詳述しています。
Abstract
着床後哺乳動物胚培養方法は、一般に非効率的であり、子宮から解剖した後の短い期間に限定されてきた。プラットフォームは最近、卵筒段階から高度な器官形成までのマウス胚の非常に堅牢で長期の 子宮外 培養のために開発されました。これらのプラットフォームは、後肢形成段階(E11)までの胃骨前胚(E5.5)の適切かつ忠実な発達を可能にする。後期胃胚(E7.5)は、これらの設定で回転ボトルで増殖するが、胃形成前段階(E5.5またはE6.5)からの拡張培養は、静的および回転ボトル培養の組み合わせを必要とする。さらに、O2 およびCO2 濃度、ガス圧、グルコースレベル、および特定の 子宮外 培養培地の使用の敏感な調節は、適切な胚発生にとって重要である。ここでは、拡張 された子宮外 マウス胚培養のための詳細なステップバイステップのプロトコールが提供される。正常なマウス胚を胃胞形成から器官形成まで 子宮外で 成長させる能力は、胚発生中の異なる実験的摂動の影響を特徴付けるための貴重なツールを表す。
Introduction
哺乳類胚の子宮内発育は、着床後発達の初期段階の研究を制限している1,2。発達中の胚にアクセスできないことは、動物の身体計画の確立、生殖層の仕様、または組織および器官の形成など、胚が子宮に移植された後に起こる重要な発生プロセスの理解を妨げる。さらに、早期移植後胚のサイズが非常に小さいため、E103の前に子宮内での生体内イメージングによる観察が困難になる。これらの段階で生きている胚を観察して操作することができないため、早期着床後胚発生の研究は発生中のスナップショットに限定されています。
着床前哺乳動物胚の体外培養のためのプロトコルは、十分に確立されており、信頼性が高く、定期的に利用されています4。それにもかかわらず、適切な哺乳動物の着床後胚成長をサポートできる元子宮培養システムを確立しようとする試みは、限られた成功にとどまった5。1世紀以上にわたり、主に従来の静的プレート6,7,8または回転ボトル(ローラー培養)5,9,10で胚を培養することによって、様々な培養技術が提案されている。これらのプラットフォームは、正常な胚生存には非常に非効率的であり、短期間に限定されているにもかかわらず、移植後の哺乳類の発達に関する知識を広げるのに有用であることが証明されました11,12。胚は、培養開始後24〜48時間で発生遅延および形態学的異常を示し始めた。
この研究は、着床後発達の最大6日間にわたって、胃形成前から高度な器官形成段階までの継続的な発達を可能にする 元子宮 胚培養システムを設定するための詳細な説明を提供する13。この論文では、E7.5胚(神経プレートおよびヘッドフォールドステージ)から後肢形成段階(〜E11)までの成長をサポートする改良されたローラー培養プロトコルと、静的プレートおよびローラー培養プラットフォーム上での培養を組み合わせることによってE5.5 / E6.5からの拡張培養について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に提示される培養プロトコールは、E5.5からE11までの6日間、子宮外で適切かつ連続的なマウス胚発生を維持することができる。以前は、これらの発生段階の胚は、短期間(最大48時間)の培養で正常に発達することができました15。酸素濃度および高圧ガス圧を正確に制御するためのローラー培養器へのガス調節モジュールの結合は、本明細書に記載の適切なマ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はパスカルとイラナ・マントゥーによって資金提供されました。欧州研究評議会(ERC-CoG-2016 726497-細胞性);客室乗務員医学研究評議会(FAMRI);イスラエルがん研究基金(ICRF)教授職、BSF、ヘレン・アンド・マーティン・キンメル幹細胞研究所、ヘレン・アンド・マーティン・キンメル賞(革新的調査)イスラエル科学財団(ISF)、ミネルバ、シャーマン薬化学研究所、ネラとレオンベノジヨ神経疾患センター、遺伝性疾患研究のためのデビッドとフェラシェイペルファミリーセンター、ケクストファミリー遺伝研究所、ベスロムライマー幹細胞研究基金、エドモンドデロスチャイルド財団、ザントカー慈善財団、ズビアゼロニの不動産。
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
Referencias
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
