Ex Utero Культура эмбрионов мышей от прегаструляции до продвинутого органогенеза
Summary
Усовершенствованная платформа для культивирования всего эмбриона позволяет непрерывно и надежно развивать ex utero постимплантационные эмбрионы мышей в течение шести дней, от стадий прегаструляции до продвинутого органогенеза. В этом протоколе мы подробно описываем стандартную процедуру успешного культивирования эмбрионов с использованием статических пластин и вращающихся бутылочных систем.
Abstract
Постимплантационные методы культивирования эмбрионов млекопитающих были, как правило, неэффективными и ограничивались короткими периодами после рассечения матки. Недавно были разработаны платформы для высокопрочной и длительной внеутробной культуры эмбрионов мышей от стадий яичного цилиндра до продвинутого органогенеза. Эти платформы обеспечивают надлежащее и достоверное развитие прегаструлирующих эмбрионов (E5.5) до стадии формирования задних конечностей (E11). Поздние гаструлирующие эмбрионы (E7.5) выращиваются во вращающихся баллонах в этих условиях, в то время как расширенная культура со стадий предварительной гаструляции (E5.5 или E6.5) требует комбинации статических и вращающихся культур бутылок. Кроме того, чувствительная регуляция концентрации O2 и CO2 , газового давления, уровня глюкозы и использования конкретной внеутробной питательной среды имеют решающее значение для правильного развития эмбриона. Здесь представлен подробный пошаговый протокол для расширенной культуры эмбрионов ex utero мыши. Способность выращивать нормальные эмбрионы мышей ex utero от гаструляции до органогенеза представляет собой ценный инструмент для характеристики эффекта различных экспериментальных возмущений во время эмбрионального развития.
Introduction
Внутриутробное развитие эмбриона млекопитающего ограничило изучение ранних стадий постимплантационного развития1,2. Недоступность развивающегося эмбриона препятствует пониманию ключевых процессов развития, происходящих после имплантации эмбриона в матку, таких как создание плана тела животного, спецификация зародышевых слоев или формирование тканей и органов. Кроме того, очень маленький размер раннего постимплантированного эмбриона затрудняет наблюдение с помощью прижизненной визуализации в утробе матери до E103. Неспособность наблюдать и манипулировать живыми эмбрионами на этих стадиях ограничила изучение раннего постимплантационного эмбриогенеза моментальными снимками во время развития.
Протоколы культивирования in vitro эмбрионов млекопитающих до имплантации хорошо зарекомендовали себя, надежны и регулярно используются4. Тем не менее, попытки создать системы внеутробных культур, способные поддерживать правильный рост эмбрионов млекопитающих после имплантации, имели ограниченный успех5. На протяжении более века предлагались различные методы культивирования, главным образом путем культивирования эмбрионов в обычных статических пластинах6,7,8 или вращающихся бутылках (роликовых культурах)5,9,10. Эти платформы оказались полезными в расширении знаний о развитии млекопитающих после имплантации11,12, несмотря на то, что они крайне неэффективны для нормальной выживаемости эмбрионов и ограничены короткими периодами. Эмбрионы начали проявлять задержку развития и морфологические аномалии уже через 24-48 ч после начала культивирования.
Это исследование дает подробное описание для создания системы культивирования эмбрионов ex utero , которая позволяет непрерывно развиваться от прегаструляции до продвинутых стадий органогенеза в течение шести дней постимплантационного развития13. В этой статье описывается улучшенный протокол культивирования роликов, который поддерживает рост эмбрионов E7.5 (нейронная пластина и стадия головы) до стадии формирования задних конечностей (~ E11) и расширенная культура из E5.5 / E6.5 путем объединения культуры на статических пластинах и платформах для культивирования роликов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол культивирования, представленный в настоящем описании, может поддерживать правильное и непрерывное развитие эмбриона мыши ex utero в течение шести дней, от E5.5 до E11. Ранее эмбрионы на этих стадиях развития могли нормально развиваться в культуре только в течение коротких перио…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Паскалем и Иланой Манту; Европейский исследовательский совет (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Совет по медицинским исследованиям стюардессы (FAMRI); Профессор Израильского фонда исследований рака (ICRF), BSF, Институт исследований стволовых клеток Хелен и Мартина Киммеля, премия Хелен и Мартина Киммеля за инновационные исследования; Израильский научный фонд (ISF), Минерва, Институт медицинской химии Шермана, Центр неврологических заболеваний Неллы и Леона Бенозийо, Семейный центр исследований генетических расстройств Дэвида и Фелы Шапелл, Институт медицинской генетики семьи Кекст, Фонд исследований стволовых клеток доктора Бет Ром-Раймер, Фонды Эдмонда де Ротшильда, Благотворительный фонд Занткера, поместье Звиа Зерони.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
Referencias
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
