Auustofori microfluidica per la separazione flowthrough di batteri Gram-negativi utilizzando perline di affinità aptamero
Summary
Questo articolo descrive la fabbricazione e il funzionamento di chip acustoforetici microfluidici utilizzando la tecnica dell’acoustophoresis microfluidica e microsfere modificate con aptamero che possono essere utilizzate per un isolamento rapido ed efficiente di batteri Gram-negativi da un mezzo.
Abstract
Questo articolo descrive la fabbricazione e il funzionamento di chip acustoforetici microfluidici utilizzando una tecnica di acoustophoresis microfluidica e microsfere modificate con aptamero che possono essere utilizzate per l’isolamento rapido ed efficiente di batteri Gram-negativi da un mezzo. Questo metodo migliora l’efficienza di separazione utilizzando un mix di microcanali lunghi e quadrati. In questo sistema, il campione e il buffer vengono iniettati nella porta di ingresso attraverso un regolatore di flusso. Per il centraggio delle sfere e la separazione del campione, l’alimentazione CA viene applicata al trasduttore piezoelettrico tramite un generatore di funzioni con un amplificatore di potenza per generare forza di radiazione acustica nel microcanale. C’è un canale biforcato sia all’ingresso che all’uscita, consentendo la separazione, la purificazione e la concentrazione simultanee. Il dispositivo ha un tasso di recupero del >98% e una purezza del 97,8% fino a una concentrazione di dose 10x. Questo studio ha dimostrato un tasso di recupero e una purezza superiori ai metodi esistenti per separare i batteri, suggerendo che il dispositivo può separare i batteri in modo efficiente.
Introduction
Sono in fase di sviluppo piattaforme microfluidiche per isolare batteri da campioni medici e ambientali, oltre a metodi basati su trasferimento dielettrico, magnetoforesi, estrazione di perline, filtraggio, microfluidica centrifuga ed effetti inerziali e onde acustiche superficiali 1,2. La rilevazione di batteri patogeni viene continuata utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR), ma di solito è laboriosa, complessa e richiede tempo 3,4. I sistemi di acoustophoresis microfluidica sono un’alternativa per affrontare questo problema attraverso una produttività ragionevole e l’isolamento cellulare senza contatto 5,6,7. L’acoustophoresis è una tecnologia che separa o concentra le perle utilizzando il fenomeno del movimento del materiale attraverso un’onda sonora. Quando le onde sonore entrano nel microcanale, vengono ordinate in base alle dimensioni, alla densità, ecc. delle perle e le cellule possono essere separate in base alle proprietà biochimiche ed elettriche del mezzo di sospensione 7,8. Di conseguenza, molti studi acustoforetici sono stati attivamente perseguiti 9,10,11, e recentemente sono state introdotte simulazioni numeriche 3D del moto acustoforetico indotto dal flusso acustico guidato dal confine nella microfluidica delle onde acustiche della superficie stazionaria12.
Studi in vari campi stanno esaminando come sostituire gli anticorpi 2,3. L’aptamero è un materiale bersaglio con elevata selettività e specificità e molti studi sono in corso 2,9,10,13. Gli aptameri hanno vantaggi di piccole dimensioni, eccellente stabilità biologica, basso costo e alta riproducibilità rispetto agli anticorpi e sono in fase di studio in applicazioni diagnostiche e terapeutiche 2,3,14.
Qui, questo articolo descrive un protocollo tecnologico di acoustophoresis microfluidica che può essere utilizzato per la separazione rapida ed efficiente dei batteri Gram-negativi (GN) da un mezzo utilizzando microsfere modificate con aptamero. Questo sistema genera un’onda stazionaria acustica bidimensionale (2D) attraverso una singola attuazione piezoelettrica stimolando simultaneamente due risonanze ortogonali all’interno di un lungo microcanale rettangolare per allineare e focalizzare le microsfere attaccate all’aptamero nei punti del nodo e dell’antinodo per l’efficienza di separazione 2,11,15,16 . C’è un canale biforcato sia all’ingresso che all’uscita, consentendo la separazione, la purificazione e la concentrazione simultanee.
Questo protocollo può essere utile nel campo della diagnosi precoce delle malattie infettive batteriche, nonché una risposta rapida, selettiva e sensibile alle infezioni batteriche patogene attraverso il monitoraggio dell’acqua in tempo reale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidico a levitazione sonica per catturare e trasferire i batteri GN da campioni di coltura ad alta velocità basato su un metodo di funzionamento continuo in base alle loro dimensioni e tipo e microsfere modificate con aptamero. Il microcanale lungo e quadrato consente una progettazione più semplice e una maggiore efficienza in termini di costi per l’acoustophoresis 2D rispetto a 20,21,22,23,24,25,26 precedentemente riportati.<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (Ministero della Scienza e delle TIC). (No. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
Referencias
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
