Acustoforesis microfluídica para la separación fluvial de bacterias gramnegativas utilizando perlas de afinidad aptámero
Summary
Este documento describe la fabricación y operación de chips acústoforeticos microfluídicos utilizando la técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio.
Abstract
Este artículo describe la fabricación y operación de chips acústoforéticos microfluídicos utilizando una técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio. Este método mejora la eficiencia de separación utilizando una mezcla de microcanales largos y cuadrados. En este sistema, la muestra y el búfer se inyectan en el puerto de entrada a través de un controlador de flujo. Para el centrado de cuentas y la separación de muestras, la alimentación de CA se aplica al transductor piezoeléctrico a través de un generador de funciones con un amplificador de potencia para generar fuerza de radiación acústica en el microcanal. Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas. El dispositivo tiene una tasa de recuperación del >98% y una pureza del 97,8% hasta una concentración de dosis 10x. Este estudio ha demostrado una tasa de recuperación y pureza más alta que los métodos existentes para separar las bacterias, lo que sugiere que el dispositivo puede separar las bacterias de manera eficiente.
Introduction
Se están desarrollando plataformas microfluídicas para aislar bacterias de muestras médicas y ambientales, además de métodos basados en transferencia dieléctrica, magnetoforesis, extracción de perlas, filtrado, microfluídica centrífuga y efectos inerciales, y ondas acústicas superficiales 1,2. La detección de bacterias patógenas se continúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero suele ser laboriosa, compleja ylenta 3,4. Los sistemas de acustoforesis microfluídica son una alternativa para abordar esto a través de un rendimiento razonable y aislamiento celular sin contacto 5,6,7. La acustoforesis es una tecnología que separa o concentra cuentas utilizando el fenómeno del movimiento del material a través de una onda sonora. Cuando las ondas sonoras entran en el microcanal, se clasifican según el tamaño, la densidad, etc., de las perlas, y las células se pueden separar de acuerdo con las propiedades bioquímicas y eléctricas del medio de suspensión 7,8. En consecuencia, se han realizado activamente muchos estudios acustoforéticos 9,10,11, y recientemente, se han introducido simulaciones numéricas 3D del movimiento acustoforético inducido por la corriente acústica impulsada por límites en microfluídica de onda acústica de superficie estacionaria 12.
Estudios en diversos campos están examinando cómo reemplazar los anticuerpos 2,3. El aptámero es un material diana de alta selectividad y especificidad, y se están realizando muchos estudios 2,9,10,13. Los aptámeros tienen ventajas de pequeño tamaño, excelente estabilidad biológica, bajo costo y alta reproducibilidad en comparación con los anticuerpos y están siendo estudiados en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas 2,3,14.
Aquí, este artículo describe un protocolo de tecnología de acustoforesis microfluídica que se puede utilizar para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas (GN) de un medio utilizando microperlas modificadas con aptámero. Este sistema genera una onda estacionaria acústica bidimensional (2D) a través de un solo accionamiento piezoeléctrico al estimular simultáneamente dos resonancias ortogonales dentro de un microcanal rectangular largo para alinear y enfocar microperlas unidas a aptámeros en los puntos nodo y antinodo para una eficiencia de separación 2,11,15,16 . Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas.
Este protocolo puede ser útil en el campo del diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas bacterianas, así como una respuesta rápida, selectiva y sensible a las infecciones bacterianas patógenas a través del monitoreo del agua en tiempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos un dispositivo microfluídico de levitación sónica para capturar y transferir bacterias GN de muestras de cultivo a alta velocidad basado en un método de funcionamiento continuo según su tamaño y tipo, y microperlas modificadas con aptámero. El microcanal largo y cuadrado permite un diseño más simple y una mayor rentabilidad para la acustoforesis 2D que la reportada anteriormente 20,21,22,23,24,25,26.<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (Ministerio de Ciencia y TIC). (No. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
Referencias
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
