Стереотаксический хирургический подход к микроинъекции каудального ствола головного и верхнего шейного отдела спинного мозга через Cisterna Magna у мышей
Summary
Стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей обычно включает доступ через кости черепа и руководствуется ориентирами черепа. Здесь мы излагаем альтернативный стереотаксический подход для нацеливания на хвостовой ствол мозга и верхний шейный отдел спинного мозга с помощью cisterna magna, который опирается на прямую визуализацию ориентиров ствола мозга.
Abstract
Стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей обычно руководствуется ориентирами черепа. Затем доступ осуществляется через отверстия заусенца, просверленные через череп. Этот стандартный подход может быть сложным для целей в хвостовом стволе мозга и верхней части шейного канатика из-за специфических анатомических проблем, поскольку эти участки удалены от ориентиров черепа, что приводит к неточности. Здесь мы излагаем альтернативный стереотаксический подход с помощью cisterna magna, который использовался для нацеливания на дискретные области, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Cisterna magna простирается от затылочной кости до атласа (т. е. второй позвоночной кости), заполнена спинномозговой жидкостью и покрыта твердой мозговой оболочкой. Этот подход обеспечивает воспроизводимый путь доступа к выбранным структурам центральной нервной системы (ЦНС), которые в противном случае трудно достичь из-за анатомических барьеров. Кроме того, он позволяет напрямую визуализировать ориентиры ствола мозга в непосредственной близости от целевых участков, повышая точность при доставке небольших объемов инъекций в ограниченные области, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Наконец, такой подход дает возможность избежать мозжечка, что может быть важно для моторных и сенсомоторных исследований.
Introduction
Стандартная стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей1 обычно включает фиксацию черепа с использованием набора ушных перекладин и ротовой панели. Затем координаты оцениваются на основе справочных атласов 2,3 и ориентиров черепа, а именно: брегма (точка, где швы лобной и теменной костей сходятся) или лямбда (точка, где швы теменной и затылочной костей сходятся; Рисунок 1А,В). Через отверстие в черепе над предполагаемой целью может быть достигнута целевая область, либо для доставки микроинъекций, либо для инструментов с помощью канюль или оптических волокон. Из-за вариации анатомии этих швов и ошибок в локализации брегмы или лямбды 4,5 положение нулевых точек по отношению к мозгу варьируется от животного к животному. Хотя небольшие ошибки в нацеливании, которые являются результатом этой изменчивости, не являются проблемой для крупных или близлежащих целей, их воздействие больше для небольших областей интереса, которые удалены от нулевых точек в переднезадней или дорсовентральной плоскостях и / или при изучении животных различного размера из-за возраста, деформации и / или пола. Существует несколько дополнительных проблем, которые являются уникальными для продолговатого мозга и верхней части шейного канатика. Во-первых, небольшие изменения переднезадных координат связаны со значительными изменениями дорсовентральных координат относительно твердой мозговой оболочки, обусловленными положением и формой мозжечка (рисунок 1Bi)2,6,7. Во-вторых, верхний шейный канатик не содержится в черепе2. В-третьих, наклонное положение затылочной кости и вышележащего слоя мышц шеи2 делает стандартный стереотаксический подход еще более сложным для структур, расположенных вблизи перехода между стволом головного и спинного мозга (рисунок 1Bi). Наконец, многие мишени, представляющие интерес в каудальном стволе мозга ишейном канатике, являются небольшими 2, требующими точных и воспроизводимых инъекций 8,9.
Альтернативный подход через cisterna magna обходит эти проблемы. Cisterna magna представляет собой большое пространство, которое простирается от затылочной кости до атласа (рисунок 1A, т. е. вторая позвоночная кость)10. Он заполнен спинномозговой жидкостью и покрыт твердой мозговой оболочкой10. Это пространство между затылочной костью и атласом открывается при антерофлексе головы. К нему можно получить доступ, перемещаясь между вышележащими парными животами мышцы longus capitis, обнажая дорсальную поверхность хвостового ствола мозга. Затем можно ориентироваться на области, представляющие интерес, на основе ориентиров самих этих регионов, если они расположены вблизи дорсальной поверхности; или с помощью obex, точки, где центральный канал открывается в IV желудочек, в качестве нулевой точки для координат, чтобы достичь более глубоких структур. Этот подход был успешно использован у различных видов, включая крысу11, кошку12, мышь 8,9 и нечеловеческого примата13 для нацеливания на вентральную респираторную группу, медуллярную медиальную ретикулярную формацию, ядро одиночных путей, область постремы или подъязычное ядро. Однако этот подход широко не используется, поскольку он требует знания анатомии, специализированного инструментария и более продвинутых хирургических навыков по сравнению со стандартным стереотаксическим подходом.
Здесь мы описываем пошаговый хирургический подход к достижению ствола мозга и верхней части шейного мозга через cisterna magna, визуализации ориентиров, установке нулевой точки (рисунок 2), а также оценке и оптимизации целевых координат для стереотаксической доставки микроинъекций в дискретные области ствола мозга и спинного мозга, представляющие интерес (рисунок 3). Затем мы обсудим преимущества и недостатки, связанные с этим подходом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стандартная стереотаксическая хирургия обычно полагается на ориентиры черепа для расчета координат целевых участков в ЦНС1. Затем доступ к целевым участкам осуществляется через отверстия для заусенцев, которые просверливаются через череп1. Этот метод н?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана R01 NS079623, P01 HL149630 и P01 HL095491.
Materials
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
Referencias
- JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. . A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004)
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
