JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

הערכת לוקומוטור של מודל מחלת פרקינסון למבוגרים המושרה על ידי 6-הידרוקסידופמין

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63355
, , , , , ,
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy,Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine,Universiti Malaya

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההזרקה התוך-חדרית (ICV) של דגי זברה בוגרים עם נוירוטוקסי-הידרוקסידופאמין (6-OHDA) בדיאנספלון הגחוני (Dn) ואת הערכת הליקוי וההתאוששות שלאחר מכן של פוסטלציה של התנהגות שחייה באמצעות מבחן הטנק הפתוח, המלווה בניתוח באמצעות תוכנת מעקב וידאו.

Abstract

המגבלות של הטיפולים הנוכחיים בעיכוב אובדן עצבי דופאמין במחלת פרקינסון (PD) להעלות את הצורך טיפולים חלופיים שיכולים לשחזר נוירונים אלה. מאמץ רב מופנה כיום להבנה טובה יותר של ניוון עצבי באמצעות מודלים פרה-קליניים ב- vivo . עם זאת, יכולת רגנרטיבית זו לתיקון עצמי אינה יעילה ביונקים. בעלי חיים שאינם יונקים כמו דגי זברה התגלו כך כמודל נוירו-גנרטיבי מצוין בשל יכולתו לחדש את עצמם ללא הרף ויש להם הומולוגיית מוח קרובה לבני אדם. כחלק מהמאמץ להבהיר אירועים תאיים המעורבים בארגון עצבי ב- vivo, הקמנו את מודל PD למבוגרים המבוסס על דגי זברה למבוגרים המושרה על ידי 6-HYDROXYDopamine (6-OHDA). זה הושג באמצעות אופטימיזציה תוך שרירית (ICV) microinjection של 99.96 mM 6-OHDA כדי במיוחד ablate נוירונים דופאמין (DpN) ב diencephalon הגחוני (Dn) של המוח דגי זברה. Immunofluorescence הצביע על יותר מ 85% של אבלציה DpN ביום השלישי postlesion ושיקום מלא של DpN באתר lesioned 30 ימים postlesionion. המחקר הנוכחי קבע את הליקוי ואת ההתאוששות שלאחר מכן של התנהגות שחייה של דגי זברה בעקבות נגע באמצעות מבחן השדה הפתוח שדרכו כימתו שני פרמטרים, מרחק נסע (ס”מ) ומהירות ממוצעת (ס”מ /s), היו מכמתים. התנועה הוערכה על ידי ניתוח ההקלטות של דגים בודדים של כל קבוצה (n = 6) באמצעות תוכנת מעקב וידאו. הממצאים הראו ירידה משמעותית (p < 0.0001) במהירות (ס"מ/ים) ובמרחק נסע (ס"מ) של דגי זברה נגועים 3 ימים postlesion בהשוואה לזיוף. דגי הזברה הנגעים הפגינו התאוששות מלאה של התנהגות השחייה 30 יום לאחר מכן. הממצאים הנוכחיים מראים כי 6-OHDA נגע זברה בוגר הוא מודל מצוין עם איכות רבייה כדי להקל על המחקר של neuroregeneration ב PD. מחקרים עתידיים על המנגנונים שבבסיס neuroregeneration, כמו גם גורמים פנימיים וחיצוניים לווסת את התהליך עשוי לספק תובנה חשובה לתוך אסטרטגיות טיפול החלפת תאים חדשים נגד PD.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD), מחלה המאופיינת באופן ייחודי על ידי קשיחות שרירים, רעד במנוחה וברדיקינזיה, היא המחלה הנוירולוגית הגדלה במהירות הגבוהה ביותר בעולם1,2. הסיכון והשכיחות של PD להגדיל במהירות עם הגיל במיוחד אצל אנשים בגילאי 50 ומעלה. האטיולוגיה והפתוגנזה של PD עד כה נשארים מובנים בצורה גרועה. זה לעתים קרובות השאיר את ההתחלה המוקדמת של PD לא מאובחנת. נכון לעכשיו, חוסר דופמין ואובדן נוירונים דופאמין (DpN) בחולי PD קשורים מאוד לביטוי של סימפטומים מוטוריים4. ניצול מערכת יחסים זו, מספר טיפולים תוכננו או לפעול ישירות כתחליף דופמין (כלומר, levodopa) או כדי לפצות על אובדן DpN (כלומר, גירוי מוחי עמוק). למרות טיפולים אלה להביא יתרונות סימפטומטיים, הם אינם משנים את מהלך הידרדרות של המחלה5. לאור חולשה משמעותית זו, הוצע טיפול בתחליפי תאים. היעילות של גישה זו, עם זאת, אינה עקבית בהתחשב באתגרים של הכנת שתל, בקרת צמיחת תאים, וחוסר יציבות פנוטיפ. טיפול בתחליפי תאים, שהעלה חששות אתיים, מהווה גם את הסיכון לגרימת גידולים במוח ותגובות חיסוניות לא רצויות6,7.

המגבלות של אסטרטגיות טיפוליות נוכחיות הובילו לדגש רב יותר על התחדשות של DpN כגישה פוטנציאלית בטיפול PD. התחדשות של DpN או neuroregeneration התפתחה כאחת מפריצות הדרך המבטיחות בניהול PD, לא רק בשל הפוטנציאל שלה כשיטה טיפולית חדשה, אלא גם כאמצעי להבין את המנגנון של המחלה8, 9. גישה זו מתמקדת בשיקום התפקוד העצבי באמצעות בידול, הגירה ושילוב של תאי אב קיימים במעגלים הנגעים10. על מנת להמשיך לחקור neuroregeneration, מחקרים שונים ב vivo בוצעו. נמצא כי בעלי חוליות כגון יונקים, דו-חיים וזוחלים מייצרים תאי מוח חדשים בעקבות פציעה של 11,12. בקרב בעלי החוליות, בעלי חיים יונקים מבוקשים יותר בהתחשב בדמיון הגנטי שלהם לבני אדם. יונקים, לעומת זאת, מפגינים יכולת תיקון מוגבלת וענייה במערכת העצבים המרכזית (CNS) שיכולה להימשך עד הבגרות בעקבות נגע במוח13. באופן כללי, יונקים אינם מתאימים כמודלים בעלי חיים להבנת neuroregeneration בהתחשב בכך מספר נמוך של נוירונים המיוצרים לא יהיה מספיק כדי לשחזר מעגלים עצביים פגומים שנצפו PD. ככזה, המודל המבוסס על טלוסט, במיוחד בדגי זברה, מועדף מאוד על קצב ההתפשטות הגבוה שלו, היכולת לחדש את עצמו ברציפות, ולסגור את ההומולוגיה המוחית עם בני אדם 14,15.

דגי זברה משמשים בדרך כלל לחקר תנועה פרועה ב- PD16. מודל PD מבוסס דגי זברה מושרה בדרך כלל על ידי רעלנים עצביים, הכוללים 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,3,6-טטרהידרופירידין (MPTP) ו 6-הידרוקסידופאמין (6-OHDA)17. למרות יעיל גרימת אובדן ספציפי של DpN וירידה של רמות הדופאמין, מודלים מבוססי MPTP אינם מחקים מקרוב את התנאים של PD כמו אובדן DpN אינו מוגבל אך ורק CNS18. חוסר היכולת של 6-OHDA לחצות את מחסום הדם – מוח הגביל את השפעותיו על שינויים תאיים ותפקודיים בתוך המוח כאשר הוא מנוהל תוך גולגולתי לעומת תוך שרירית19. ניהול היקפי של 6-OHDA גרם לירידה גלובלית של רמות הדופאמין בכל מערכת העצבים20. בעוד מתן של 6-OHDA לתוך הנוזל השדרתי גרם אבלציה של DpN ברחבי CNS21, אשר אינו מחקה את המצב כפי שנראה PD לפיו אובדן DpN מתרחשת במיוחד בסובסטנציה ניגרה של המוח האנושי. ניהול ICV של 6-OHDA, להיפך, במיוחד גרם אבלציה משמעותית של DpN באזור של Dn הגחון במוח דג הזברה, אשר דומה מאוד סובסטנציה nigra22. מעניין, התאוששות של DpN דווחה 30 ימים לאחר נגע 6-OHDA המושרה נוירונים אלה שרדו במהלך החיים23,24. ההתאוששות הפונקציונלית של DpN הודגמה באמצעות הערכת לוקומוטור של המרחק שעבר (ס”מ) ומהירות ממוצעת (ס”מ/ים) באמצעות דגם PD למבוגרים מבוסס זברה 6-OHDA מבוססי דגי זברה22.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים ואתיקה (CARE), האוניברסיטה טכנולוגית MARA (UiTM) [התייחסות לא: UiTM CARE 346/2021, מיום 7 במאי 2021]. הערה: הפרוטוקולים שפורסמו2,25,26 עבור גידול ותחזוקה סטנדרטיים של מודל PD דג זברה למבוגרים 6-OHDA נגע נוצלו.<s…

Representative Results

הניסוי הנוכחי העריך את השינויים בהתנהגות השחייה של דגי זברה למבוגרים בעקבות מיקרו-ICV עם 6-OHDA. הסיבה לשימוש 6-OHDA כמו neurotoxin של בחירה נבע חוסר היכולת שלה לחצות את מחסום הדם – מוח, אשר הפיק אבלציה ספציפית וממוקדת של DpN בתחום של דיאנספלון עניין-גחון (Dn)16. אוכלוסיית המשנה של DpN כאן מחזיקה…

Discussion

העבודה הנוכחית הדגימה בהצלחה את הערכת הלוקומוטור של מודל ה-PD המבוסס על דגי זברה למבוגרים בגודל 6-OHDA. הניסוי כולו כלל שלושה שלבים עיקריים: תכשירי מיקרו-ג’ינג’ים טרום-ICV, מיקרו-ICV של דגי זברה והערכה של לוקומוטור. כדי להבטיח התאוששות בריאה של דגי זברה בוגרים בעקבות הליך microinjection ICV ותוצאה ניסיוני?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המשרד להשכלה גבוהה מלזיה במסגרת תוכנית מענק המחקר הבסיסי [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].

Materials

Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA – version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson’s Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
  3. Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson’s Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
  4. Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
  5. Cookson, M. R. . Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , 157-174 (2017).
  6. Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
  7. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
  8. Foltynie, T. Can Parkinson’s disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
  9. Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
  10. Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
  11. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  12. Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
  13. La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
  14. Ferretti, P., Prasongchean, W. . Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , 1-21 (2015).
  15. Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson’s Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
  16. Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson’s disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
  17. Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
  18. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  19. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
  20. Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
  21. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  22. Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson’s disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
  23. Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
  24. Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
  25. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
  26. Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
  27. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  28. Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
  29. Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
  30. Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
  31. Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson’s disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
  32. Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
  33. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  34. Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
  35. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  36. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
  37. Barbosa Júnior, A., et al. . Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, 323-330 (2012).
  38. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
  39. Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
  40. Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
  41. Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
  42. Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
  43. Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
  44. Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
  45. Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
  46. Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
  47. Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
  48. Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
  49. Burghardt, G. M., et al. Perspectives – Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
  50. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  51. Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
  52. Beal, M. F. Parkinson’s disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
  53. Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
  54. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).

Tags

Keywords: ZebrafishParkinson’s Disease6-hydroxydopamineLocomotor AssessmentMotor ImpairmentDopaminergic NeuronsIntracerebroventricular InjectionNeuroregenerationCell ReplacementTricaine MethanesulfonateAnesthesiaMicrocapillary Injector
check_url/es/63355?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson’s Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image