Локомоторная оценка 6-гидроксидофамин-индуцированной модели болезни Паркинсона у взрослых рыбок данио
Summary
Настоящий протокол описывает интрацеребровентрикулярную (ICV) инъекцию взрослым рыбкам данио нейротоксического 6-гидроксидофамина (6-OHDA) в вентральный диэнцефалон (Dn) и оценку нарушения и последующее восстановление плавательного поведения после этого с использованием теста в открытом резервуаре, который сопровождается анализом с использованием программного обеспечения для отслеживания видео.
Abstract
Ограничения современных методов лечения в задержке дофаминергической потери нейронов при болезни Паркинсона (БП) повышают потребность в альтернативных методах лечения, которые могут восстановить эти нейроны. В настоящее время много усилий направлено на лучшее понимание нейрорегенерации с использованием доклинических моделей in vivo . Однако эта регенеративная способность к самовосстановлению неэффективна у млекопитающих. Таким образом, животные, не являющиеся млекопитающими, такие как рыбки данио, стали отличной нейрорегенеративной моделью из-за ее способности постоянно самообновляться и иметь близкую гомологию мозга к людям. В рамках усилий по выяснению клеточных событий, участвующих в нейрорегенерации in vivo, мы создали модель БП взрослых рыбок данио, индуцированную 6-гидроксидотамином (6-OHDA). Это было достигнуто за счет оптимизированной интрацеребровентрикулярной (ICV) микроинъекции 99,96 мМ 6-OHDA для специфического абляции дофаминергических нейронов (DpN) в вентральном диэнцефалоне (Dn) мозга рыбок данио. Иммунофлуоресценция показала более 85% абляции DpN на третий день после поражения и полное восстановление DpN на участке поражения через 30 дней после поражения. Настоящее исследование определило ухудшение и последующее восстановление плавательного поведения рыбок данио после поражения с помощью теста в открытом поле, с помощью которого были количественно определены два параметра, пройденное расстояние (см) и средняя скорость (см/с). Локомоцию оценивали путем анализа записей отдельных рыб каждой группы (n = 6) с использованием программного обеспечения для отслеживания видео. Результаты показали значительное (p < 0,0001) снижение скорости (см / с) и пройденного расстояния (см) пораженных рыбок данио через 3 дня по сравнению с фикцией. Пораженная рыбка данио продемонстрировала полное восстановление плавательного поведения через 30 дней после высадки. Представленные результаты показывают, что 6-OHDA пораженная взрослая рыбка данио является отличной моделью с воспроизводимым качеством для облегчения изучения нейрорегенерации при БП. Будущие исследования механизмов, лежащих в основе нейрорегенерации, а также внутренних и внешних факторов, которые модулируют процесс, могут дать важное представление о новых стратегиях клеточной заместительной терапии против БП.
Introduction
Болезнь Паркинсона (БП), заболевание, характеризующееся мышечной ригидностью, тремором покоя и брадикинезией, является самым быстрорастущим неврологическим заболеванием в мире1,2. Риск и распространенность БП быстро увеличиваются с возрастом, особенно у лиц в возрасте 50 лет и старше3. Этиология и патогенез БП до сих пор остаются малоизученными. Это часто оставляло раннее начало БП недиагностированным. В настоящее время недостаток дофамина и потеря дофаминергических нейронов (DpN) у пациентов с БП тесно связаны с проявлением двигательной симптоматики4. Используя эту связь, несколько методов лечения были разработаны либо для того, чтобы действовать непосредственно как замена дофамина (то есть леводопа), либо для компенсации потери DpN (то есть глубокой стимуляции мозга). Хотя эти методы лечения приносят симптоматические преимущества, они не изменяют ухудшающееся течение заболевания5. Ввиду этой значительной слабости была предложена клеточная заместительная терапия. Эффективность этого подхода, однако, непоследовательна, учитывая проблемы подготовки трансплантата, контроля роста клеток и нестабильности фенотипа. Клеточная заместительная терапия, которая вызвала этические проблемы, также представляет риск индуцирования опухолей головного мозга и нежелательных иммунных реакций6,7.
Ограничения современных терапевтических стратегий привели к большему акценту на регенерацию DpN как потенциальный подход в лечении БП. Регенерация DpN или нейрорегенерация стала одним из многообещающих прорывов в лечении БП не только из-за ее потенциала в качестве нового терапевтического метода, но и как средства для понимания механизма заболевания8, См. 9. Этот подход фокусируется на восстановлении функции нейронов путем дифференцировки, миграции и интеграции существующих клеток-предшественников в поврежденную схему10. В целях дальнейшего изучения нейрорегенерации были проведены различные исследования in vivo. Было обнаружено, что позвоночные, такие как млекопитающие, амфибии и рептилии, генерируют новые клетки мозга после травмы11,12. Среди позвоночных млекопитающие животные более востребованы, учитывая их генетическое сходство с людьми. Млекопитающие, однако, демонстрируют ограниченную и плохую репаративную способность в центральной нервной системе (ЦНС), которая может длиться до взрослой жизни после поражения мозга13. В целом, млекопитающие не подходят в качестве животных моделей для понимания нейрорегенерации, учитывая, что низкое количество производимых нейронов будет недостаточным для восстановления поврежденных нейронных цепей, наблюдаемых при БП. Таким образом, модель на основе телеоста, особенно у рыбок данио, пользуется большим преимуществом из-за ее высокой пролиферативной скорости, способности к непрерывному самообновлению и закрытию гомологии мозга с людьми14,15.
Рыбки данио чаще всего используются для изучения беспорядочного движения при PD16. Модель БП на основе рыбок данио обычно индуцируется нейротоксинами, которые включают 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) и 6-гидроксидофамин (6-OHDA)17. Несмотря на эффективность в индуцировании удельной потери DpN и снижения уровня дофамина, модели на основе MPTP не точно имитируют условия PD, поскольку потеря DpN не ограничивается исключительно CNS18. Неспособность 6-OHDA пересекать гематоэнцефалический барьер ограничивала его влияние на клеточные и функциональные изменения в мозге, когда он вводится интракраниально, а не внутримышечно19. Периферическое введение 6-OHDA вызвало глобальное снижение уровня дофамина во всей нервной системе20. В то время как введение 6-OHDA в спинномозговую жидкость вызывало абляцию DpN по всему ЦНС21, что не имитирует состояние, наблюдаемое при БП, при котором потеря DpN происходит конкретно в черной субстанции человеческого мозга. Введение ICV 6-OHDA, напротив, специфически индуцировало значительную абляцию DpN в области вентрального Dn в мозге рыбок данио, которая очень напоминала substantia nigra22. Интересно, что восстановление DpN было зарегистрировано через 30 дней после 6-OHDA-индуцированного поражения, и эти нейроны выжили в течение жизни23,24. Функциональное восстановление DpN было продемонстрировано с помощью локомоторной оценки пройденного расстояния (см) и средней скорости (см/с) с использованием модели PD на основе 6-OHDA-индуцированной взрослой рыбки данио22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящая работа успешно продемонстрировала локомоторную оценку установленной 6-OHDA-индуцированной, взрослой модели PD на основе рыбок данио. Весь эксперимент включал в себя три основных этапа: подготовка микроинъекции до ICV, микроинъекция ICV рыбок данио и оценка локомоторов. Чтобы обес?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством высшего образования Малайзии в рамках Схемы грантов на фундаментальные исследования [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
| Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | – | version 7.0; video tracking software |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
| Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
| LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
Referencias
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson’s Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
- Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson’s Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
- Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
- Cookson, M. R. . Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , 157-174 (2017).
- Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
- Foltynie, T. Can Parkinson’s disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
- Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
- Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
- La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
- Ferretti, P., Prasongchean, W. . Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , 1-21 (2015).
- Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson’s Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
- Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson’s disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
- Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
- Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson’s disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
- Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
- Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson’s disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
- Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
- Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
- Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
- Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
- Barbosa Júnior, A., et al. . Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, 323-330 (2012).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
- Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
- Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
- Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
- Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
- Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
- Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
- Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
- Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
- Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
- Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
- Burghardt, G. M., et al. Perspectives – Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
- Beal, M. F. Parkinson’s disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
- Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
