الانحناء الكابولي من الرقاب الفخذية Murine

Summary

يصف هذا البروتوكول تطوير منصة اختبار قابلة للتكرار لأعناق الفخذ الفئرانية في إعداد الانحناء الكابولي. تم استخدام أدلة مطبوعة 3D مخصصة لإصلاح عظم الفخذ باستمرار وصرامة في المحاذاة المثلى.

Abstract

الكسور في عنق الفخذ هي أمر شائع الحدوث في الأفراد الذين يعانون من هشاشة العظام. تم تطوير العديد من نماذج الفئران لتقييم حالات المرض والعلاجات ، مع الاختبار الميكانيكي الحيوي كمقياس أساسي للنتائج. ومع ذلك ، تركز الاختبارات الميكانيكية الحيوية التقليدية على اختبارات الالتواء أو الانحناء المطبقة على العمود الأوسط للعظام الطويلة. هذا ليس عادة موقع الكسور عالية الخطورة في الأفراد المصابين بهشاشة العظام. لذلك ، تم تطوير بروتوكول اختبار ميكانيكي حيوي يختبر أعناق الفخذ الفخذية لعظم الفخذ في تحميل ثني الكابولي لتكرار أنواع الكسور التي يعاني منها مرضى هشاشة العظام بشكل أفضل. نظرا لأن النتائج الميكانيكية الحيوية تعتمد اعتمادا كبيرا على اتجاه التحميل الانحنائي بالنسبة إلى عنق الفخذ ، فقد تم إنشاء أدلة مطبوعة ثلاثية الأبعاد للحفاظ على عمود الفخذ بزاوية 20 درجة بالنسبة لاتجاه التحميل. قام البروتوكول الجديد بتبسيط الاختبار عن طريق تقليل التباين في المحاذاة (21.6 درجة ± 1.5 درجة ، COV = 7.1٪ ، n = 20) وتحسين قابلية التكرار في النتائج الميكانيكية الحيوية المقاسة (متوسط COV = 26.7٪). النهج الجديد باستخدام أدلة مطبوعة 3D لمحاذاة العينات الموثوقة يحسن الصرامة والتكرار عن طريق تقليل أخطاء القياس بسبب اختلال محاذاة العينات ، والتي يجب أن تقلل من أحجام العينات في دراسات الفئران لهشاشة العظام.

Introduction

خطر الكسر هو مصدر قلق طبي خطير مرتبط بهشاشة العظام. يتم الإبلاغ عن أكثر من 1.5 مليون كسر هشاشة كل عام في الولايات المتحدة وحدها ، مع حدوث كسور في الورك ، وتحديدا عنق الفخذ ، باعتباره نوع الكسر الرئيسي ¹. تشير التقديرات إلى أن 18٪ من النساء و 6٪ من الرجال سيعانون من كسر عنق الفخذ في ^{حياتهم2 ،} ومعدل الوفيات في سنة واحدة بعد الكسر أكبر من 20٪ ¹. لذلك ، يمكن أن تكون نماذج الفئران التي تسمح بالاختبار الميكانيكي الحيوي لعنق الفخذ مناسبة لدراسة كسور الهشاشة. توفر نماذج الفئران أيضا أدوات قوية لتوضيح الأحداث الخلوية والجزيئية القابلة للترجمة التي تنطوي عليها هشاشة العظام المحتملة. ويرجع ذلك إلى توافر المراسلين الوراثيين ، وكسب وفقدان نماذج الوظائف ، والمكتبة الواسعة للتقنيات الجزيئية والكواشف. يمكن أن يوفر الاختبار الميكانيكي لعظام الفئران تدابير النتائج اللازمة لتحديد صحة العظام والاختلافات الجينية والمظهرية التي يمكن أن تفسر مسببات المرض، وتقييم العلاجات بناء على مقاييس النتائج لجودة العظام وخطر ^الكسر3.

يخلق تشريح عنق الفخذ سيناريوهات تحميل ميكانيكية فريدة من نوعها ، والتي تؤدي عادة إلى كسور الانحناء (الانحناء). يتم تحميل رأس الفخذ في المقبس الحقي في الطرف القريب من عظم الفخذ. وهذا يخلق سيناريو الانحناء الكابولي على عنق الفخذ، والذي يرتبط بشكل صارم بالعمود الفخذي بشكل ^بعيد4. هذا يختلف عن اختبارات الانحناء التقليدية المكونة من 3 أو 4 نقاط على الحجاب الحاجز المتوسط الفخذي. في حين أن هذه الاختبارات مفيدة ، إلا أنها لا تكرر التحميل الذي يؤدي عادة إلى كسور هشاشة في الأفراد الذين يعانون من هشاشة العظام وهشاشة العظام من حيث موقع الكسر أو سيناريو التحميل.

لتقييم خطر كسر الهشاشة في الفئران بشكل أفضل ، تم السعي إلى تحسين قابلية تكرار اختبارات ثني الكابولي لأعناق الفخذ الفئران. وكما هو متوقع نظريا، فقد تبين أن زاوية التحميل على رأس الفخذ بالنسبة إلى العمود الفخذي تؤثر تأثيرا كبيرا على مقاييس ^{النتائج5}، مما يخلق تحديا لموثوقية النتائج المبلغ عنها وإمكانية تكرارها. لضمان المحاذاة المناسبة والمتسقة لعظم الفخذ أثناء إعداد العينة، تم تصميم الأدلة، وطبعت 3D على أساس القياسات التشريحية التي أجريت على مسح μCT لعظم الفخذ C57BL/6 الماوس. تم تصميم الأدلة للمساعدة في وضع العينات باستمرار بحيث يتم الحفاظ على العمود الفخذي عند ~ 20 درجة من اتجاه التحميل الرأسي. تم اختيار هذه الزاوية لأنها تزيد من الصلابة مع تقليل لحظة الانحناء القصوى على طول العمود الفخذي ، مما يزيد من احتمال حدوث كسور في عنق الفخذ ويؤدي إلى اختبار أكثر اتساقا وقابلية ^{للتكرار5}. كانت الأدلة مطبوعة 3D بأحجام مختلفة لاستيعاب الاختلافات التشريحية بين العينات وتستخدم لعقد العينات في وضع مستقر أثناء وضع الأواني في الأسمنت العظمي الأكريليك. تم حساب الصلابة والقوة القصوى وقوة الخضوع والطاقة القصوى من الرسوم البيانية لإزاحة القوة. أظهرت طريقة الاختبار هذه نتائج متسقة للنتائج الميكانيكية الحيوية المذكورة أعلاه. مع الممارسة ومساعدة الدليل المطبوع 3D ، يمكن تقليل أخطاء القياس بسبب عدم المحاذاة ، مما يؤدي إلى مقاييس نتائج موثوقة.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة الموارد الحيوانية بجامعة روتشستر. كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة C57BL/6 من الذكور والإناث تتراوح أعمارهم بين 24-29 أسبوعا من العمر. تم إيواء الفئران في ظروف قياسية مع الطعام والماء ad. عند القتل الرحيم عن طريق استنشاق ثاني أكسيد ال…

Representative Results

عند وضعها في وعاء بمساعدة الدليل ، تمت محاذاة أعمدة الفخذ عند 21.6 درجة ± 1.5 درجة. في حين أن هذا يمثل انحرافا بنسبة <10٪ عن الزاوية المقصودة البالغة 20 درجة، فإن معاملات التباين (COV) لزاوية الأصيص عبر جميع العينات التي تم اختبارها كانت 7.6٪ و 6.5٪ للفئران الذكور والإناث، على التوالي (n = 10 لكل مجموعة) ?…

Discussion

يحدد هذا البروتوكول اختبار ثني ناتئ موثوق به لأعناق الفخذ الفئران. عادة ما لا يتم تمثيل سيناريو الانثناء الكابولي الطبيعي الذي يحدث في عنق الفخذ في اختبارات الانحناء القياسية المكونة من 3 و 4 ^نقاط5. طريقة الاختبار هذه أفضل وأكثر موثوقية تكرر نوع كسور عنق الفخذ التي يعاني منها م…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.