Cantilever Bending von murinen Oberschenkelhälsen

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung einer reproduzierbaren Testplattform für murine Femurhälse in einem Freischwinger-Biegeaufbau. Kundenspezifische 3D-gedruckte Führungen wurden verwendet, um die Oberschenkelknochen konsequent und starr in optimaler Ausrichtung zu fixieren.

Abstract

Frakturen im Oberschenkelhals treten häufig bei Personen mit Osteoporose auf. Viele Mausmodelle wurden entwickelt, um Krankheitszustände und Therapien zu bewerten, wobei biomechanische Tests ein primäres Ergebnismaß sind. Traditionelle biomechanische Tests konzentrieren sich jedoch auf Torsions- oder Biegetests, die auf die Mittelwelle der langen Knochen angewendet werden. Dies ist in der Regel nicht der Ort von Hochrisikofrakturen bei osteoporotischen Personen. Daher wurde ein biomechanisches Testprotokoll entwickelt, das die Oberschenkelhälse von murinen Femuren in der Cantilever-Biegebelastung testet, um die Arten von Frakturen, die von Osteoporosepatienten erlebt werden, besser zu replizieren. Da die biomechanischen Ergebnisse stark von der Biegebelastungsrichtung relativ zum Oberschenkelhals abhängen, wurden 3D-gedruckte Führungen erstellt, um einen Femurschaft in einem Winkel von 20° relativ zur Belastungsrichtung aufrechtzuerhalten. Das neue Protokoll rationalisierte die Tests, indem es die Variabilität der Ausrichtung (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) reduzierte und die Reproduzierbarkeit der gemessenen biomechanischen Ergebnisse verbesserte (durchschnittlicher COV = 26,7%). Der neue Ansatz, der die 3D-gedruckten Leitfäden für eine zuverlässige Probenausrichtung verwendet, verbessert die Strenge und Reproduzierbarkeit, indem die Messfehler aufgrund von Probenfehlausrichtungen reduziert werden, was die Stichprobengrößen in Mausstudien zur Osteoporose minimieren sollte.

Introduction

Das Frakturrisiko ist ein ernstes medizinisches Problem im Zusammenhang mit Osteoporose. Allein in den Vereinigten Staaten werden jedes Jahr über 1,5 Millionen Fragilitätsfrakturen gemeldet, wobei Frakturen in der Hüfte, insbesondere im Oberschenkelhals, als führender ^Frakturtyp1 auftreten. Es wird geschätzt, dass 18% der Frauen und 6% der Männer in ihrem Leben eine Oberschenkelhalsfraktur erleiden ^werden2, und die Sterblichkeitsrate nach 1 Jahr nach der Fraktur ist größer als 20%¹. Daher können Mausmodelle, die eine biomechanische Untersuchung des Oberschenkelhalses ermöglichen, für die Untersuchung von Fragilitätsfrakturen geeignet sein. Mausmodelle bieten auch leistungsstarke Werkzeuge, um übersetzbare zelluläre und molekulare Ereignisse aufzuklären, die potenziell an Osteoporose beteiligt sind. Dies ist auf die Verfügbarkeit genetischer Reporter, den Gewinn und Verlust von Funktionsmodellen und die umfangreiche Bibliothek molekularer Techniken und Reagenzien zurückzuführen. Mechanische Tests von Mausknochen können notwendige Ergebnismessungen liefern, um die Knochengesundheit, genotypische und phänotypische Variationen zu bestimmen, die die Ätiologie der Krankheit erklären könnten, und Therapien auf der Grundlage von Ergebnismessungen der Knochenqualität und des Frakturrisikos zu ^bewerten3.

Die Anatomie des Oberschenkelhalses erzeugt einzigartige mechanische Belastungsszenarien, die typischerweise zu Biege- (Biege-) Frakturen führen. Der Hüftkopf wird in der Hüftpfanne am proximalen Ende des Femurs belastet. Dadurch entsteht ein Cantilever-Biegeszenario am Oberschenkelhals, der starr am Femurschaft distal befestigt ^ist4. Dies unterscheidet sich von herkömmlichen 3- oder 4-Punkt-Biegetests an der Femurmitteldiaphyse. Während diese Tests hilfreich sind, replizieren sie nicht die Belastung, die typischerweise zu Fragilitätsfrakturen bei osteopenischen und osteoporotischen Personen in Bezug auf die Frakturlokalisation oder das Belastungsszenario führt.

Um das Fragilitätsfrakturrisiko bei Mäusen besser beurteilen zu können, wurde versucht, die Reproduzierbarkeit von Freischwinger-Biegetests an murinen Oberschenkelhälsen zu verbessern. Wie theoretisch vorhergesagt, hat sich gezeigt, dass der Belastungswinkel des Hüftkopfes im Verhältnis zum Oberschenkelschaft die Ergebnismessungen signifikant ^beeinflusst5, wodurch eine Herausforderung für die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der berichteten Ergebnisse entsteht. Um eine korrekte und konsistente Ausrichtung der Oberschenkelknochen während der Probenvorbereitung zu gewährleisten, wurden Leitfäden entworfen und auf der Grundlage anatomischer Messungen an μCT-Scans von C57BL/6-Maus-Femuren in 3D gedruckt. Die Führungen wurden entwickelt, um das gleichmäßige Einfüllen der Proben zu unterstützen, so dass der Oberschenkelschaft bei ~ 20 ° von der vertikalen Belastungsrichtung gehalten wird. Dieser Winkel wurde gewählt, weil er die Steifigkeit maximiert und gleichzeitig das maximale Biegemoment entlang des Oberschenkelschafts minimiert, was die Wahrscheinlichkeit von Oberschenkelhalsfrakturen erhöht und zu konsistenteren und reproduzierbareren Tests ^führt5. Die Führungen wurden in verschiedenen Größen in 3D gedruckt, um anatomische Unterschiede zwischen den Proben auszugleichen, und verwendet, um Proben in einer stabilen Position zu halten, während sie in Acrylknochenzement eingegossen wurden. Die Steifigkeit, die maximale Kraft, die Streckgrenze und die maximale Energie wurden aus den Kraft-Weg-Diagrammen berechnet. Diese Testmethode zeigte konsistente Ergebnisse für das oben genannte biomechanische Ergebnis. Mit Übung und hilfe der 3D-gedruckten Führung können Messfehler durch Fehlausrichtung minimiert werden, was zu zuverlässigen Ergebnismessungen führt.

Protocol

Tierversuche wurden vom Committee of Animal Resources der University of Rochester genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse waren C57BL/6 Männer und Frauen im Alter von 24-29 Wochen. Mäuse wurden unter Standardbedingungen mit Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht. Nach der Euthanasie durch Kohlendioxidinhalation, gefolgt von einer zervikalen Luxation, wurden 20 rechte Oberschenkelknochen (10 männliche und 10 weibliche) geerntet und bei -20 °C eingefroren, bis sie getestet wurden. <p class=…

Representative Results

Beim Verguss mit Hilfe der Führung wurden die Oberschenkelschäfte bei 21,6° ± 1,5° ausgerichtet. Während dies <10% Abweichung vom beabsichtigten Winkel von 20° entspricht, betrugen die Variationskoeffizienten (COV) des Vergusswinkels über alle getesteten Proben hinweg 7,6% bzw. 6,5% für männliche und weibliche Mäuse (n = 10 pro Gruppe), wie durch planare Röntgenaufnahmen vor dem Test verifiziert wurde (Abbildung 5). Darüber hinaus sollten die Röntgenaufnahmen nach dem Test verw…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen zuverlässigen Cantilever-Biegetest für murine Oberschenkelhälse. Das natürliche Cantilever-Biegeszenario, das am Oberschenkelhals auftritt, wird in standardisierten 3- und 4-Punkt-Biegetests typischerweise nicht ^dargestellt5. Diese Testmethode ist besser und repliziert zuverlässiger die Art von Oberschenkelhalsfrakturen, die bei Knochenbrüchigkeitspatienten auftreten. Das Hauptaugenmerk bei der Durchführung dieses Protokolls liegt auf der Beseitigung der Va…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.