Le présent protocole décrit le développement d’une plate-forme d’essai reproductible pour les cols fémoraux murins dans une configuration de flexion en porte-à-faux. Des guides imprimés en 3D personnalisés ont été utilisés pour fixer de manière cohérente et rigide les fémurs dans un alignement optimal.
Les fractures du col du fémur sont fréquentes chez les personnes atteintes d’ostéoporose. De nombreux modèles murins ont été développés pour évaluer les états pathologiques et les thérapies, avec des tests biomécaniques comme mesure de résultat principal. Cependant, les essais biomécaniques traditionnels se concentrent sur les essais de torsion ou de flexion appliqués à l’arbre médian des os longs. Ce n’est généralement pas le site des fractures à haut risque chez les personnes ostéoporotiques. Par conséquent, un protocole de test biomécanique a été développé qui teste le cou fémoral des fémurs murins dans la charge de flexion en porte-à-faux pour mieux reproduire les types de fractures subies par les patients atteints d’ostéoporose. Étant donné que les résultats biomécaniques dépendent fortement de la direction de charge de flexion par rapport au col du fémur, des guides imprimés en 3D ont été créés pour maintenir un arbre fémoral à un angle de 20 ° par rapport à la direction de charge. Le nouveau protocole a simplifié les tests en réduisant la variabilité de l’alignement (21,6 ° ± 1,5 °, COV = 7,1 %, n = 20) et en améliorant la reproductibilité des résultats biomécaniques mesurés (COV moyen = 26,7 %). La nouvelle approche utilisant les guides imprimés en 3D pour un alignement fiable des échantillons améliore la rigueur et la reproductibilité en réduisant les erreurs de mesure dues au désalignement des échantillons, ce qui devrait minimiser la taille des échantillons dans les études sur l’ostéoporose chez la souris.
Le risque de fracture est un problème médical grave associé à l’ostéoporose. Plus de 1,5 million de fractures de fragilité sont signalées chaque année aux États-Unis seulement, avec des fractures survenant à la hanche, en particulier au col du fémur, comme principale fracture de type1. On estime que 18 % des femmes et 6 % des hommes subiront une fracture du col du fémur au cours de leur vie2, et le taux de mortalité à 1 an après la fracture est supérieur à 20 %1. Par conséquent, les modèles murins qui permettent des tests biomécaniques du col du fémur peuvent convenir à l’étude des fractures de fragilité. Les modèles murins offrent également des outils puissants pour élucider les événements cellulaires et moléculaires traduisibles impliqués dans l’ostéoporose potentiellement. Cela est dû à la disponibilité de rapporteurs génétiques, au gain et à la perte de modèles fonctionnels et à la vaste bibliothèque de techniques moléculaires et de réactifs. Les tests mécaniques sur les os de souris peuvent fournir les mesures de résultats nécessaires pour déterminer la santé des os, les variations génotypiques et phénotypiques qui pourraient expliquer l’étiologie de la maladie, et évaluer les thérapies en fonction des mesures des résultats de la qualité de l’os et du risque de fracture3.
L’anatomie du col du fémur crée des scénarios de charge mécanique uniques, qui conduisent généralement à des fractures de flexion (flexion). La tête fémorale est chargée dans la cavité acétabulaire à l’extrémité proximale du fémur. Cela crée un scénario de flexion en porte-à-faux sur le col fémoral, qui est fixé de manière rigide à la tige fémorale distalement4. Cela diffère des tests de flexion traditionnels à 3 ou 4 points sur la diaphyse moyenne fémorale. Bien que ces tests soient utiles, ils ne reproduisent pas la charge qui conduit généralement à des fractures de fragilité chez les personnes ostéopéniques et ostéoporotiques en termes de localisation de la fracture ou de scénario de charge.
Pour mieux évaluer le risque de fracture de fragilité chez la souris, il a été cherché à améliorer la reproductibilité des tests de flexion en porte-à-faux du col fémoral murin. Comme on l’avait prédit théoriquement, il a été démontré que l’angle de charge sur la tête fémorale par rapport à l’arbre fémoral influe de manière significative sur les mesures des résultats5, créant ainsi un défi pour la fiabilité et la reproductibilité des résultats rapportés. Pour assurer un alignement correct et cohérent des fémurs pendant la préparation de l’échantillon, des guides ont été conçus et imprimés en 3D sur la base de mesures anatomiques effectuées sur des scans μCT de fémurs de souris C57BL/6. Les guides ont été conçus pour aider à rempoter systématiquement les échantillons de manière à ce que l’arbre fémoral soit maintenu à ~ 20 ° de la direction de chargement verticale. Cet angle a été choisi parce qu’il maximise la rigidité tout en minimisant le moment de flexion maximal le long de l’arbre fémoral, ce qui augmente le risque de fractures du col du fémur et conduit à des tests plus cohérents et reproductibles5. Les guides ont été imprimés en 3D dans différentes tailles pour tenir compte des différences anatomiques entre les échantillons et utilisés pour maintenir les échantillons dans une position stable tout en rempotant dans du ciment osseux acrylique. La rigidité, la force maximale, la force d’élasticité et l’énergie maximale ont été calculées à partir des graphiques force-déplacement. Cette méthode d’essai a montré des résultats cohérents pour le résultat biomécanique susmentionné. Avec la pratique et l’aide du guide imprimé en 3D, les erreurs de mesure dues à un désalignement peuvent être minimisées, ce qui permet d’obtenir des mesures de résultats fiables.
Ce protocole décrit un test de flexion en porte-à-faux fiable pour les cols fémoraux murins. Le scénario de flexion naturelle en porte-à-faux qui se produit au niveau du col du fémur n’est généralement pas représenté dans les tests de flexion standard à 3 et 4 points5. Cette méthode de test est meilleure et reproduit de manière plus fiable le type de fractures du col du fémur subies par les patients atteints de fragilité osseuse. L’objectif principal lors de l’exécution de ce…
The authors have nothing to disclose.
L’étude a été soutenue par les NIH P30AR069655 et R01AR070613 (H. A. A.).
¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |