Murine Femoral Boyunların Kantilever Bükülmesi
Summary
Mevcut protokol, bir kantilever bükme kurulumunda murine femoral boyunlar için tekrarlanabilir bir test platformunun geliştirilmesini açıklamaktadır. Femurları optimum hizalamada tutarlı ve sert bir şekilde sabitlemek için özel 3D baskılı kılavuzlar kullanılmıştır.
Abstract
Femoral boyundaki kırıklar osteoporozlu bireylerde sık görülen bir durumdur. Birçok fare modeli, birincil sonuç ölçüsü olarak biyomekanik testlerle hastalık durumlarını ve tedavilerini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, geleneksel biyomekanik testler, uzun kemiklerin orta mili için uygulanan burulma veya bükme testlerine odaklanır. Bu tipik olarak osteoporotik bireylerde yüksek riskli kırıkların yeri değildir. Bu nedenle, osteoporoz hastalarının yaşadığı kırık türlerini daha iyi çoğaltmak için kantilever bükme yüklemesinde murin femurların femoral boyunlarını test eden bir biyomekanik test protokolü geliştirilmiştir. Biyomekanik sonuçlar femoral boyuna göre bükülmesel yükleme yönüne oldukça bağlı olduğundan, yükleme yönüne göre 20 ° açıyla femoral bir şaft tutmak için 3D baskılı kılavuzlar oluşturulmuştur. Yeni protokol, hizalamadaki değişkenliği (21,6° ± 1,5°, COV = %7,1, n = 20) ve ölçülen biyomekanik sonuçlarda (ortalama COV = %26,7) geliştirilmiş tekrarlanabilirliği azaltarak testi kolaylaştırdı. Güvenilir numune hizalaması için 3D baskılı kılavuzları kullanan yeni yaklaşım, osteoporoz fare çalışmalarında örnek boyutlarını en aza indirmesi gereken numune yanlış hizalaması nedeniyle ölçüm hatalarını azaltarak titizliği ve tekrarlanabilirliği artırır.
Introduction
Kırık riski osteoporoz ile ilişkili ciddi bir tıbbi endişedir. Sadece Amerika Birleşik Devletleri’nde her yıl 1,5 milyondan fazla kırılganlık kırığı rapor edilir ve kalçada, özellikle femoral boyunda kırıklar meydana gelmektedir. Kadınların %18’inin, erkeklerin ise %6’sının yaşamları boyunca femoral boyun kırığı yaşayacağı tahmin edilmektedir2 ve kırığı takip eden 1 yıldaki ölüm oranı %20’den fazladır 1. Bu nedenle, femoral boynun biyomekanik testine izin veren fare modelleri kırılganlık kırıklarını incelemek için uygun olabilir. Fare modelleri ayrıca osteoporozda potansiyel olarak yer alan çevrilebilir hücresel ve moleküler olayları aydınlatmak için güçlü araçlar sunar. Bunun nedeni genetik muhabirlerin mevcudiyeti, fonksiyon modellerinin kazanımı ve kaybı ve moleküler teknikler ve reaktiflerin geniş kütüphanesidir. Fare kemiklerinin mekanik testleri, hastalığın etiyolojisini açıklayabilecek kemik sağlığı, genotipik ve fenotipik varyasyonları belirlemek ve kemik kalitesinin ve kırılma riskinin sonuç ölçülerine dayanarak tedavileri değerlendirmek için gerekli sonuç önlemlerini sağlayabilir3.
Femoral boynun anatomisi, tipik olarak bükülme (bükülme) kırıklarına yol açan benzersiz mekanik yükleme senaryoları oluşturur. Femoral kafa, uyluk kemiğinin proksimal ucundaki asetabuler sokete yüklenir. Bu, femoral şafta sert bir şekilde bağlı olan femoral boyunda bir kantilever bükme senaryosu oluşturur4. Bu, femoral orta diafiz üzerinde yapılan geleneksel 3 veya 4 noktalı bükme testlerinden farklıdır. Bu testler yararlı olmakla birlikte, osteopenik ve osteoporotik bireylerde tipik olarak kırılganlık kırıklarına yol açan yüklemeyi kırık yeri veya yükleme senaryosu açısından çoğaltmaz.
Farelerde kırılganlık kırığı riskini daha iyi değerlendirmek için, murine femoral boyunların kantilever bükme testlerinin tekrarlanabilirliğini artırmaya çalışılmıştı. Teorik olarak tahmin edildiği gibi, femoral şafta göre femoral kafadaki yükleme açısının sonuç ölçülerini önemli ölçüde etkilediği gösterilmiştir5, böylece bildirilen sonuçların güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği için bir zorluk yaratmıştır. Numune hazırlama sırasında uyluk kemiğinin doğru ve tutarlı hizalamasını sağlamak için kılavuzlar tasarlanmış ve C57BL/6 fare uyluk kemiğinin μCT taramalarında yapılan anatomik ölçümlere dayanarak 3D baskı yapılmıştır. Kılavuzlar, femoral şaftın dikey yükleme yönünden ~20° olarak muhafaza edildiği şekilde numunelerin sürekli olarak saksılanmasına yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu açı, femoral şaft boyunca maksimum bükme momentini en aza indirirken sertliği en üst düzeye çıkarırken, femoral boyun kırıkları olasılığını artırdığı ve daha tutarlı ve tekrarlanabilir testlere yol açtığı için seçildi5. Kılavuzlar, numuneler arasındaki anatomik farklılıkları karşılamak için çeşitli boyutlarda 3D olarak basıldı ve akrilik kemik çimentosunda saksı yaparken numuneleri sabit bir konumda tutmak için kullanıldı. Sertlik, maksimum kuvvet, verim kuvveti ve maksimum enerji kuvvet-yer değiştirme grafiklerinden hesaplanmıştır. Bu test yöntemi, yukarıda belirtilen biyomekanik sonuç için tutarlı sonuçlar göstermiştir. Uygulama ve 3D baskılı kılavuzun yardımıyla, yanlış hizalama nedeniyle ölçüm hataları en aza indirilebilir ve bu da güvenilir sonuç önlemlerine neden olur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, murine femoral boyunlar için güvenilir bir kantilever bükme testine ana hatlarıyla bakmaktadır. Femoral boyunda meydana gelen doğal kantilever fleksür senaryosu tipik olarak standart 3 ve 4 nokta bükme testlerinde temsil değildir5. Bu test yöntemi daha iyi ve daha güvenilir bir şekilde kemik kırılganlığı hastalarının yaşadığı femoral boyun kırıklarının tipini çoğaltır. Bu protokolü gerçekleştirirken ana odak noktası, femoral şaftın tutarsız saksıs…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma NIH P30AR069655 ve R01AR070613 (H. A. A.) tarafından desteklendi.
Materials
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
Referencias
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. . Bone Mechanics Handbook. Second end. , (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J. Osteoporosis and its complications. Medical Clinics of North America. 98 (4), 817-831 (2014).
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. . Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
