Крупномасштабное автоматизированное производство сфероидов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для 3D-биопечати
Summary
Здесь мы описываем крупномасштабное производство сфероидов стромальных/стволовых клеток (ASC) жирового происхождения с использованием автоматизированной системы пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. Эти сфероиды ASC могут быть использованы в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.
Abstract
Стромальные/стволовые клетки , полученные из жировой ткани (ИСС), представляют собой субпопуляцию клеток, обнаруженных в стромальной сосудистой фракции подкожной жировой клетчатки человека, признанной классическим источником мезенхимальных стромальных / стволовых клеток. Многие исследования были опубликованы с ASC для подходов тканевой инженерии на основе каркасов, которые в основном изучали поведение этих клеток после их посева на биоактивные каркасы. Тем не менее, появляются подходы без каркаса для инженерии тканей in vitro и in vivo, в основном с использованием сфероидов, чтобы преодолеть ограничения подходов на основе каркасов.
Сфероиды представляют собой 3D-микроткани, образованные процессом самосборки. Они могут лучше имитировать архитектуру и микроокружение нативных тканей, в основном из-за увеличения межклеточных и межклеточных матриксных взаимодействий. В последнее время сфероиды в основном исследуются в качестве моделей заболеваний, исследований скрининга лекарств и строительных блоков для 3D-биопечати. Однако для подходов к 3D-биопечати для биофабрикатирования сложных моделей тканей и органов необходимы многочисленные сфероиды, однородные по размеру и форме. Кроме того, когда сфероиды производятся автоматически, существует мало шансов на микробиологическое загрязнение, повышающее воспроизводимость метода.
Крупномасштабное производство сфероидов считается первым обязательным этапом для разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием тканевой конструкции в биореакторах. Тем не менее, количество исследований, в которых изучалось крупномасштабное производство сфероидов ASC, по-прежнему ограничено, вместе с количеством исследований, в которых использовались сфероиды ASC в качестве строительных блоков для 3D-биопечати. Таким образом, эта статья направлена на то, чтобы показать крупномасштабное производство сфероидов ASC с использованием неадгезивного микроформованного гидрогеля, распространяющего СФЕРОИДЫ ASC в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.
Introduction
Сфероиды считаются бесконтактным подходом в тканевой инженерии. ИСС способны образовывать сфероиды в процессе самосборки. 3D-микроархитектура сфероида увеличивает регенеративный потенциал ИСС, включая дифференциацию в несколько линий 1,2,3. Эта исследовательская группа работает со сфероидами ASC для инженерии хряща и костной ткани 4,5,6. Что еще более важно, сфероиды считаются строительными блоками в биофабрикации тканей и органов, в основном из-за их способности к слиянию.
Использование сфероидов для формирования тканей зависит от трех основных моментов: (1) разработка стандартизированных и масштабируемых роботизированных методов их биофабрикации7, (2) систематическое фенотипирование тканевых сфероидов8, (3) разработка методов сборки 3D-тканей9. Эти сфероиды могут быть сформированы с различными типами клеток и получены с помощью различных методов, включая висячую каплю, реагрегацию, микрофлюидику и микромолоды 8,9,10. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки, связанные с однородностью размеров и формы сфероидов, восстановлением сфероидов после образования, количеством производимых сфероидов, автоматизацией процессов, трудоемкостью и затратами11.
В методе микроформования клетки дозируются и осаждаются в нижней части микромоли из-за силы тяжести. Неадгезивный гидрогель не позволяет клеткам прилипать к дну, а межклеточные взаимодействия приводят к образованию одного сфероида за спад 8,12. Этот метод биофабрикации генерирует сфероиды однородного и контролируемого размера, может быть роботизирован для крупномасштабного производства эффективным по времени способом с минимальными усилиями и имеет хорошие затратоэффективно-критические факторы при проектировании биофабрикации тканевого сфероида 7,8. Этот метод может быть применен для формирования сфероидов любой клеточной линии для получения нового типа ткани с предсказуемыми, оптимальными и контролируемыми характеристиками8.
Биофабрикация определяется как «автоматизированная генерация биологически функциональных продуктов со структурной организацией…»13. Поэтому автоматизированное производство сфероидов считается первым обязательным этапом разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием биопечатной ткани путем слияния сфероидов. В этом исследовании, чтобы улучшить масштабируемость биофабрикации сфероидов ASC, мы используем автоматизированную систему пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. В данной работе показано, что удалось получить большое количество (тысячи) сфероидов, необходимых для 3D-биопечати подходов к биофабрикату более сложных тканевых моделей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе представлена крупномасштабная генерация сфероидов ASC с использованием автоматизированной системы пипеток. Критическим этапом протокола является точная настройка программного обеспечения для обеспечения правильного объема суспензии ячейки, скорости и расстояния дл?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Национальный институт метрологии, качества и технологии (INMETRO, RJ, Бразилия) за использование их объектов. Это исследование было частично поддержано Фондом Карлоса Шагаса Филью по поддержке исследований штата Рио-де-Жанейро (Faperj) (финансовый кодекс: E26/202.682/2018 и E-26/010.001771/2019), Национальным советом по научно-техническому развитию (CNPq) (финансовый код: 307460/2019-3) и Управлением военно-морских исследований (ONR) (финансовый код: N62909-21-1-2091). Эта работа была частично поддержана Национальным центром науки и технологий по регенеративной медицине INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
Referencias
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
