Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D
Summary
Aquí, describimos la producción a gran escala de esferoides estromales /células madre (ASC) derivados de tejido adiposo utilizando un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Estos esferoides ASC se pueden utilizar como bloques de construcción para enfoques de bioimpresión 3D.
Abstract
Las células estromales/madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son una subpoblación de células que se encuentran en la fracción vascular estromal del tejido adiposo subcutáneo humano reconocido como una fuente clásica de células estromales/madre mesenquimales. Se han publicado muchos estudios con ASC para enfoques de ingeniería de tejidos basados en andamios, que exploraron principalmente el comportamiento de estas células después de su siembra en andamios bioactivos. Sin embargo, están surgiendo enfoques libres de andamios para diseñar tejidos in vitro e in vivo, principalmente mediante el uso de esferoides, para superar las limitaciones de los enfoques basados en andamios.
Los esferoides son microtejidos 3D formados por el proceso de autoensamblaje. Pueden imitar mejor la arquitectura y el microambiente de los tejidos nativos, principalmente debido a la ampliación de las interacciones de célula a célula y de célula a matriz extracelular. Recientemente, los esferoides se están explorando principalmente como modelos de enfermedades, estudios de detección de drogas y bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Sin embargo, para los enfoques de bioimpresión 3D, numerosos esferoides, homogéneos en tamaño y forma, son necesarios para biofabricar modelos complejos de tejidos y órganos. Además, cuando los esferoides se producen automáticamente, hay pocas posibilidades de contaminación microbiológica, lo que aumenta la reproducibilidad del método.
La producción a gran escala de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa de la construcción de tejidos en biorreactores. Sin embargo, el número de estudios que exploraron la producción de esferoides ASC a gran escala aún es escaso, junto con el número de estudios que utilizaron esferoides ASC como bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo mostrar la producción a gran escala de esferoides ASC utilizando una técnica de hidrogel micromoldeado no adhesivo que difunde los esferoides ASC como bloques de construcción para los enfoques de bioimpresión 3D.
Introduction
Los esferoides se consideran un enfoque libre de andamios en la ingeniería de tejidos. Los ASC son capaces de formar esferoides mediante el proceso de autoensamblaje. La microarquitectura 3D del esferoide aumenta el potencial regenerativo de los ASC, incluida la capacidad de diferenciación en múltiples linajes 1,2,3. Este grupo de investigación ha estado trabajando con esferoides ASC para la ingeniería de cartílago y tejido óseo 4,5,6. Más importante aún, los esferoides se consideran bloques de construcción en la biofabricación de tejidos y órganos, principalmente debido a su capacidad de fusión.
El uso de esferoides para la formación de tejidos depende de tres puntos principales: (1) el desarrollo de métodos robóticos estandarizados y escalables para su biofabricación7, (2) el fenotipado sistemático de esferoides tisulares8, (3) el desarrollo de métodos para el ensamblaje de tejidos 3D9. Estos esferoides se pueden formar con diferentes tipos de células y obtenerse a través de diversos métodos, incluyendo gota colgante, reagregación, microfluídica y micromoldes 8,9,10. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas relacionadas con la homogeneidad del tamaño y la forma de los esferoides, la recuperación de los esferoides después de la formación, el número de esferoides producidos, la automatización del proceso, la intensidad de la mano de obra y los costos11.
En el método del micromoldo, las células se dispensan y se depositan en la parte inferior del micromoldo debido a la gravedad. El hidrogel no adhesivo no permite que las células se adhieran al fondo, y las interacciones de célula a célula conducen a la formación de un solo esferoide por recesión 8,12. Este método de biofabricación genera esferoides de tamaño homogéneo y controlado, puede ser robotizado para la producción a gran escala de una manera eficiente en el tiempo con el mínimo esfuerzo, y tiene buenos factores críticos de costo-efectividad en el diseño de una biofabricación de esferoide tisular 7,8. Este método se puede aplicar para formar esferoides de cualquier linaje celular para preparar un nuevo tipo de tejido con características predecibles, óptimas y controlables8.
La biofabricación se define como “la generación automatizada de productos biológicamente funcionales con organización estructural…”13. Por lo tanto, la producción automatizada de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa del tejido bioimpreso por fusión esferoide. En este estudio, para mejorar la escalabilidad de la biofabricación de esferoides ASC, utilizamos un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Este artículo muestra que fue posible producir un gran número (miles) de esferoides necesarios para los enfoques de bioimpresión 3D para biofabricar modelos de tejidos más complejos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta la generación a gran escala de esferoides ASC utilizando un sistema automatizado de pipetas. El paso crítico del protocolo es configurar con precisión el software para garantizar el volumen correcto de suspensión de celdas, velocidad y distancia para el pipeteo. Los parámetros descritos en el protocolo se determinaron después de una serie de ensayos para optimizar la dispensación de la suspensión celular ASC en los pocillos de placas de 12 pocillos que contienen los hidrogeles micromoldead…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Instituto Nacional de Metrología, Calidad y Tecnología (INMETRO, RJ, Brasil) por el uso de sus instalaciones. Este estudio fue parcialmente apoyado por la Fundación Carlos Chagas Filho para el Apoyo a la Investigación del Estado de Río de Janeiro (Faperj) (Código financiero: E26/202.682/2018 y E-26/010.001771/2019), el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) (código financiero: 307460/2019-3) y la Oficina de Investigaciones Navales (ONR) (código financiero: N62909-21-1-2091). Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Centro Nacional de Ciencia y Tecnología en Medicina Regenerativa-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
Referencias
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