3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산
Summary
여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASCs)는 중간엽 기질 / 줄기 세포의 고전적인 원천으로 인정되는 인간 피하 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 발견되는 세포의 하위 집단입니다. 스캐폴드 기반 조직 공학 접근법에 대한 ASC와 함께 많은 연구가 발표되었으며, 주로 생리 활성 스캐폴드에 시딩 한 후 이러한 세포의 행동을 탐구했습니다. 그러나, 스캐폴드-프리 접근법은 스캐폴드-기반 접근법의 한계를 극복하기 위해 주로 스페로이드를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 조직을 설계하기 위해 등장하고 있다.
구상체는 자기 조립 공정에 의해 형성된 3D 미세조직이다. 그들은 주로 세포 대 세포 및 세포 대 세포 매트릭스 상호 작용의 확대로 인해 네이티브 조직의 구조와 미세 환경을 더 잘 모방 할 수 있습니다. 최근에는 구상체가 주로 질병 모델, 약물 스크리닝 연구 및 3D 바이오 프린팅을위한 빌딩 블록으로 탐구되고 있습니다. 그러나 3D 바이오 프린팅 접근법의 경우 크기와 모양이 균질 한 수많은 구상체가 복잡한 조직 및 장기 모델을 생물로 제작하는 데 필요합니다. 또한, 구상체가 자동으로 생성되면 미생물 오염의 가능성이 거의 없으므로 방법의 재현성이 높아집니다.
구상체의 대규모 생산은 3D 바이오 프린팅 공정에서 계속되고 생물 반응기에서 조직 구성물의 완전한 성숙으로 끝나는 생물 제조 라인을 개발하기위한 첫 번째 필수 단계로 간주됩니다. 그러나 대규모 ASC 스페로이드 생산을 탐구 한 연구의 수는 ASC 구상체를 3D 바이오 프린팅의 빌딩 블록으로 사용한 연구의 수와 함께 여전히 부족합니다. 따라서, 본 글은 3D 바이오프린팅 접근법의 빌딩 블록으로서 ASC 구상체를 확산시키는 비접착성 마이크로몰딩 하이드로겔 기술을 이용한 ASC 구상체의 대규모 생산을 보여주는 것을 목표로 한다.
Introduction
구상체는 조직 공학에서 스캐폴드가없는 접근법으로 간주됩니다. ASC는 자체 조립 공정에 의해 구상체를 형성 할 수 있습니다. 스페로이드의 3D 마이크로 아키텍처는 ASC의 재생 잠재력을 증가시키며, 여기에는 여러 계보 1,2,3으로의 분화 능력이 포함됩니다. 이 연구 그룹은 연골 및 뼈 조직 공학 4,5,6을 위해 ASC 구상체와 협력하고 있습니다. 더 중요한 것은, 구상체는 주로 융합 능력으로 인해 조직과 기관의 생물 조작에서 빌딩 블록으로 간주됩니다.
조직 형성을위한 구상체의 사용은 세 가지 주요 포인트에 달려 있습니다 : (1) 생물 제조를위한 표준화되고 확장 가능한 로봇 방법의 개발7, (2) 조직 구상체의 체계적인 표현형8, (3) 3D 조직의 조립을위한 방법의 개발9. 이들 구상체는 상이한 세포 유형으로 형성될 수 있고, 교수형 드롭, 재응집, 미세유체학, 및 마이크로몰드 8,9,10을 포함하는 다양한 방법을 통해 수득될 수 있다. 이들 방법들 각각은 구상체의 크기 및 형상의 균질성, 형성 후 구상체의 회수, 생산된 구상체의 수, 공정 자동화, 노동 강도 및 비용(11)과 관련된 장단점을 갖는다.
마이크로몰드 방법에서, 세포는 중력 때문에 마이크로몰드의 바닥에 분배되고 증착된다. 비접착성 하이드로겔은 세포가 바닥에 부착하는 것을 허용하지 않으며, 세포-대-세포 상호작용은 후퇴 당 단일 스페로이드의 형성을 유도한다 8,12. 이 생물 제조 방법은 균일하고 통제 된 크기의 구상체를 생성하고, 최소한의 노력으로 시간 효율적인 방식으로 대규모 생산을 위해 로봇화 될 수 있으며, 조직 스페로이드 7,8의 생물 제조 설계에 비용 효율성이 중요한 요소를 가지고 있습니다. 이 방법은 예측 가능하고 최적이며 조절 가능한 특성을 갖는 새로운 조직 유형을 제조하기 위해 임의의 세포 계보의 구상체를 형성하는데 적용될 수 있다8.
생물 제조는 “구조적 조직을 가진 생물학적 기능성 제품의 자동화 된 생성”으로 정의됩니다 …”13. 따라서 구상체의 자동 생산은 3D 바이오 프린팅 공정에서 계속되고 스페로이드 융합에 의한 생체 인쇄 조직의 완전한 성숙으로 마무리되는 생물 제조 라인을 개발하기위한 첫 번째 필수 단계로 간주됩니다. 이 연구에서는 ASC 스페로이드 생물 제조의 확장 성을 향상시키기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 세포 현탁액을 시드하여 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 논문은 더 복잡한 조직 모델을 생물 제조하기위한 3D 바이오 프린팅 접근법에 필요한 많은 수의 (수천)의 구상체를 생산할 수 있음을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 백서에서는 자동화된 피펫 시스템을 사용하여 대규모 ASC 구상체 생성을 제시합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 피펫팅을위한 셀 서스펜션, 속도 및 거리의 올바른 볼륨을 보장하기 위해 소프트웨어를 정확하게 설정하는 것입니다. 프로토콜에 기재된 파라미터는 마이크로몰딩된, 비부착성 하이드로겔을 함유하는 12-웰 플레이트의 웰 내로 ASC 세포 현탁액의 분배를 최적화하기 위한 다수의 시?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 시설의 사용에 대한 계측, 품질 및 기술의 국립 연구소 (INMETRO, RJ, 브라질)에 감사드립니다. 이 연구는 Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of Rio de Janeiro (Faperj) (금융 코드 : E26 / 202.682 / 2018 및 E-26 / 010.001771 / 2019), National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (재무 코드 : 307460 / 2019-3) 및 해군 연구 사무소 (ONR) (재무 코드 : N62909-21-1-2091)가 부분적으로 지원했습니다. 이 연구는 재생 의학-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/)에 관한 국립 과학 기술 센터 (National Center of Science and Technology)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
Referencias
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
