コエンザイムQ過剰の設定におけるミトコンドリア透過性転移細孔の開放確率の評価
Summary
この方法は、低コンダクタンスプロトンリークに対するミトコンドリア透過性遷移細孔の寄与を利用して、野生型対照と比較して心筋細胞ミトコンドリアコエンザイムQ含量が増加した新生児脆弱X症候群マウスにおける細孔開放の電圧閾値を決定する。
Abstract
ミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)は、健康と病気に重要な電位依存性の非選択的、内側ミトコンドリア膜(IMM)メガチャネルです。mPTPは、低コンダクタンス開口時にIMMを横切る陽子の漏れを媒介し、シクロスポリンA(CsA)によって特異的に阻害される。コエンザイムQ(CoQ)はmPTPの調節因子であり、脆弱X症候群(FXS、 Fmr1 ノックアウト)の新生児マウスモデルにおける前脳および心臓ミトコンドリアにおけるmPTPのCoQ含有量およびオープン確率において組織特異的な差異が見出されている。我々は、この変異株におけるmPTP開口の電圧閾値を決定する技術を開発し、プロトンリークチャネルとしてのmPTPの役割を利用した。
これを行うために、酸素消費量と膜電位(ΔΨ)は、漏れ呼吸中にポラログラフィーとテトラフェニルホスホニウム(TPP+)イオン選択電極を使用して、単離されたミトコンドリアで同時に測定されました。mPTP開口の閾値は、特定の膜電位におけるプロトンリークのCsA媒介性阻害の開始によって決定された。このアプローチを使用して、mPTPの電圧ゲーティングの違いは、CoQ過剰の文脈で正確に定義されました。この新規技術は、mPTPの低コンダクタンス開口部の生理学的および病理学的調節の理解を深めるための将来の研究を可能にするであろう。
Introduction
mPTPは透過性遷移(PT)を媒介し、それによってIMMは小分子および溶質1,2に対して突然透過性になる。この顕著な現象は、酸化的リン酸化3に必要な電気化学的勾配を確立するための基本であるIMMの特徴的な不透過性からの明確な逸脱である。PTは、他のミトコンドリア輸送機構とは異なり、高コンダクタンス、非特異的、および非選択的プロセスであり、最大1.5kDa4、5の範囲の分子の通過を可能にする。mPTPはIMM内の電位依存性チャネルであり、その開口部はΔΨ、ATP産生、カルシウム恒常性、活性酸素種(ROS)産生、および細胞生存率4を変化させる。
病理学的極限では、mPTPの制御不能で長期にわたる高コンダクタンス開口部は、電気化学的勾配の崩壊、マトリックス腫脹、マトリックスピリジンヌクレオチドの枯渇、外膜破裂、膜間タンパク質(シトクロムcを含む)の放出、および最終的には細胞死4,6をもたらす。このような病理学的mPTP開口は、心臓虚血・再灌流傷害、心不全、外傷性脳損傷、種々の神経変性疾患、および糖尿病に関与している1、7。しかしながら、低コンダクタンスmPTP開口は本質的に生理学的であり、高コンダクタンス開口とは対照的に、深い脱分極またはミトコンドリア腫脹をもたらさない4。
細孔の低コンダクタンス開口部は、透過性を〜300Daに制限し、ATP合成とは無関係にプロトンの通過を可能にし、そして生理学的プロトンリーク5の潜在的な発生源である。生理学的mPTP開口は、ΔΨの制御された減少を引き起こし、呼吸輸送鎖を通る電子流束を増加させ、スーパーオキシドの短いバーストまたはフラッシュをもたらし、ROSシグナル伝達に寄与する8。このような一過性のmPTP開口の調節は、カルシウム恒常性ならびに正常な細胞発生および成熟にとって重要である4、9、10、11。例えば、発達中のニューロンにおける一過性の細孔開放は分化を誘発し、一方、mPTPの閉鎖は未熟心筋細胞における成熟を誘導する4,5。
健康と疾患におけるmPTPの機能的意義は十分に確立されているが、その正確な分子的同一性は依然として議論されている。mPTPの分子構造と機能に関する進歩は、他の場所で包括的にレビューされている12。簡単に言えば、現在、mPTPの高コンダクタンス状態および低コンダクタンス状態は、別個の実体12によって媒介されると仮定されている。主要な候補は、それぞれ高コンダクタンスモードおよび低コンダクタンスモード用のF1/F0 ATP合成酵素(ATP合成酵素)およびアデニンヌクレオチドトランスポーター(ANT)である12。
mPTPの孔形成成分の正確な同一性に関するコンセンサスの欠如にもかかわらず、特定の重要な特性が詳述されている。mPTPの十分に確立された特徴は、IMMの脱分極が細孔開口部13につながるように電気化学的勾配によって調節されることである。以前の研究は、ビシナルチオール基の酸化還元状態がmPTPの電圧ゲーティングを変化させ、酸化が比較的高いΔΨsで細孔を開き、チオール基の減少が閉mPTP確率をもたらすことを示している14。しかしながら、タンパク質性電圧センサの同一性は不明である。
細孔の開放確率を調節する様々な小分子が同定されている。例えば、mPTPは、カルシウム、無機リン酸、脂肪酸、およびROSで開くように刺激することができ、アデニンヌクレオチド(特にADP)、マグネシウム、プロトン、およびCsA5、12によって阻害され得る。これらの調節因子のいくつかの作用機序が解明されている。ミトコンドリアカルシウムは、ATP合成酵素15のβサブユニットに結合することによって少なくとも部分的にmPTP開口を誘発する。ROSは、ADPに対する親和性を低下させ、最も研究されたタンパク質性mPTP活性化剤16であるサイクロフィリンD(CypD)に対する親和性を増強することによって、mPTPを活性化することができる。無機リン酸や脂肪酸によるmPTPの活性化のメカニズムはあまり明らかではない。内因性阻害剤については、ADPはANTまたはATP合成酵素で結合することによってmPTPを阻害すると考えられ、マグネシウムはその結合部位からカルシウムを置換することによってその阻害効果を発揮すると考えられている15,17,18,19。
低pHは、ATP合成酵素12、20、21の調節オリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)サブユニットのヒスチジン112をプロトン化することによってmPTP開口を阻害する。mPTPのプロトタイプ薬理学的阻害剤であるCsAは、CypDを結合させ、OSCP22,23との会合を予防することによって作用する。これまでの研究はまた、様々なCoQ類似体がmPTPと相互作用し、それを阻害または活性化することを示した24。最近の研究では、新生児FXSマウス仔の前脳ミトコンドリアにおけるCoQ欠損による病理学的に開放的なmPTP、過剰なプロトン漏出、および非効率的な酸化的リン酸化の証拠を発見した25。
外因性CoQによる細孔の閉鎖は、病的陽子漏出を遮断し、樹状突起棘25の形態学的成熟を誘導した。興味深いことに、同じ動物において、FXS心筋細胞は、野生型対照と比較して過剰なCoQレベルおよび閉mPTP確率を有していた26。CoQレベルのこれらの組織特異的な差異の原因は不明であるが、この知見は、内因性CoQがmPTPの主要な調節因子である可能性が高いという概念を強調している。しかし、mPTPのCoQ媒介性阻害のメカニズムは不明のままであるため、我々の知識には大きなギャップがある。
mPTPの調節は、細胞シグナル伝達および生存の重要な決定因子である4。したがって、ミトコンドリア内のmPTP開口部を検出することは、特定の病態生理学的メカニズムを考える際に重要である。典型的には、高コンダクタンス細孔開口の閾値は、透過性遷移をトリガするためにカルシウムを用いて決定される。このようなカルシウム負荷は、膜電位の崩壊、酸化的リン酸化の急速な脱結合、およびミトコンドリア腫脹27、28をもたらす。我々は、低コンダクタンスmPTPの開口部を その場で、 それ自体を誘導することなく検出する方法の開発を目指し た。
このアプローチは、プロトンリークチャネルとしてのmPTPの役割を利用する。そうするために、クラーク型およびTPP+ イオン選択電極を用いて、漏出呼吸中の単離ミトコンドリアにおける酸素消費量および膜電位をそれぞれ同時に測定した29。mPTP開口の閾値は、特定の膜電位におけるプロトンリークのCsA媒介性阻害の開始によって決定された。このアプローチを用いて、CoQ過剰の文脈におけるmPTPの電圧ゲーティングの違いが正確に定義された。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、mPTPのオープン確率を評価する方法について述べる。具体的には、低コンダクタンスmPTPオープニングの電圧閾値は、ΔΨの範囲にわたるプロトンリークに対するCsA阻害の影響を評価することによって決定された。この技術を用いて、FXSマウスとFVB対照との間のmPTPの電圧ゲーティングの違いを、組織特異的CoQ含量の違いと一致するように同定することができた。この方法論の成功に不…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH/NIGMS T32GM008464(K.K.G.)、コロンビア大学アーヴィング医療センター麻酔科への機会プロボスト目標賞(K.K.G.)、小児麻酔学会若手研究者研究賞(K.K.G.)、NIH/NINDS R01NS112706(R.J.L.)
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
Referencias
- Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
- Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
- Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W., Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).
- Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Biología del desarrollo. 426 (1), 1-7 (2017).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
- Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
- Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
- Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
- Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
- Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
- Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
- Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
- Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
- Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
- Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
- Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
- Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
- Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
- Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
- Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
- Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
- Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
- Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
- Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).
- Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
- Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).
- Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).
- Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
- Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
- Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).
