Este método explota la contribución del poro de transición de permeabilidad mitocondrial a la fuga de protones de baja conductancia para determinar el umbral de voltaje para la apertura de poros en ratones con síndrome de X frágil neonatal con mayor contenido de coenzima Q mitocondrial de cardiomiocitos en comparación con el control de tipo salvaje.
El poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) es un megacanal de membrana mitocondrial interna (IMM) dependiente de voltaje, no selectivo, importante en la salud y la enfermedad. El mPTP media la fuga de protones a través de la IMM durante la apertura de baja conductancia y es específicamente inhibido por la ciclosporina A (CsA). La coenzima Q (CoQ) es un regulador de la mPTP, y se han encontrado diferencias específicas en el tejido en el contenido de CoQ y la probabilidad abierta de la mPTP en las mitocondrias del cerebro anterior y del corazón en un modelo de ratón recién nacido del síndrome de X frágil (FXS, Fmr1 knockout). Desarrollamos una técnica para determinar el umbral de voltaje para la apertura de mPTP en esta cepa mutante, explotando el papel del mPTP como un canal de fuga de protones.
Para ello, el consumo de oxígeno y el potencial de membrana (ΔΨ) se midieron simultáneamente en mitocondrias aisladas mediante polarografía y un electrodo selectivo de iones tetrafenilfosfonio (TPP+) durante la respiración por fuga. El umbral para la apertura de mPTP se determinó por el inicio de la inhibición mediada por CsA de la fuga de protones en potenciales de membrana específicos. Utilizando este enfoque, las diferencias en la tensión de cierre del mPTP se definieron con precisión en el contexto del exceso de CoQ. Esta novedosa técnica permitirá futuras investigaciones para mejorar la comprensión de la regulación fisiológica y patológica de la apertura de baja conductancia de la mPTP.
El mPTP media la transición de permeabilidad (PT), por lo que el IMM se vuelve abruptamente permeable a moléculas pequeñas y solutos 1,2. Este llamativo fenómeno es una clara desviación de la impermeabilidad característica de la IMM, que es fundamental para establecer el gradiente electroquímico necesario para la fosforilación oxidativa3. Pt, a diferencia de otros mecanismos de transporte mitocondrial, es un proceso de alta conductancia, inespecífico y no selectivo, que permite el paso de una gama de moléculas de hasta 1,5 kDa 4,5. El mPTP es un canal dependiente de voltaje dentro del IMM cuya abertura altera ΔΨ, la producción de ATP, la homeostasis del calcio, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la viabilidad celular4.
En el extremo patológico, la apertura incontrolada y prolongada de alta conductancia de mPTP conduce al colapso del gradiente electroquímico, hinchazón de la matriz, agotamiento de los nucleótidos de piridina de la matriz, ruptura de la membrana externa, liberación de proteínas intermembrana (incluido el citocromo c) y, en última instancia, muerte celular 4,6. Dicha apertura patológica de mPTP se ha implicado en la lesión por isquemia-reperfusión cardíaca, insuficiencia cardíaca, lesión cerebral traumática, diversas enfermedades neurodegenerativas y diabetes 1,7. Sin embargo, la apertura mPTP de baja conductancia es de naturaleza fisiológica y, a diferencia de la apertura de alta conductancia, no conduce a una despolarización profunda o hinchazón mitocondrial4.
La apertura de baja conductancia del poro restringe la permeabilidad a ~ 300 Da, permite el paso de protones independientemente de la síntesis de ATP y es una fuente potencial de fuga fisiológica de protones5. La apertura fisiológica de mPTP causa una disminución controlada de ΔΨ, aumenta el flujo de electrones a través de la cadena de transporte respiratorio y da como resultado una breve ráfaga o destello de superóxido, lo que contribuye a la señalización ros8. La regulación de dicha apertura transitoria de mPTP es importante para la homeostasis del calcio y el desarrollo y maduración celular normal 4,9,10,11. La apertura transitoria de los poros en las neuronas en desarrollo, por ejemplo, desencadena la diferenciación, mientras que el cierre de la mPTP induce la maduración en cardiomiocitos inmaduros 4,5.
Aunque la importancia funcional de la mPTP en la salud y la enfermedad está bien establecida, su identidad molecular precisa sigue siendo objeto de debate. El progreso en la estructura molecular y la función de la mPTP se ha revisado exhaustivamente en otra parte12. Brevemente, actualmente, se ha planteado la hipótesis de que los estados de alta y baja conductancia del mPTP están mediados por distintas entidades12. Los principales candidatos son la ATP sintasa F1/F0 (ATP sintasa) y el transportador de nucleótidos de adenina (ANT) para los modos de alta y baja conductancia, respectivamente12.
A pesar de la falta de consenso con respecto a la identidad exacta del componente formador de poros del mPTP, se han detallado ciertas características clave. Una característica bien establecida del mPTP es que está regulado por el gradiente electroquímico tal que la despolarización del IMM conduce a la apertura del poro13. Trabajos anteriores han demostrado que el estado redox de los grupos tiol vicinales altera la tensión de cierre del mPTP, de modo que la oxidación abre el poro a ΔΨs relativamente más altos, y la reducción del grupo tiol da como resultado una probabilidad cerrada de mPTP14. Sin embargo, se desconoce la identidad del sensor de voltaje proteínico.
Se han identificado varias moléculas pequeñas que modulan la probabilidad abierta del poro. Por ejemplo, el mPTP puede ser estimulado para abrirse con calcio, fosfato inorgánico, ácidos grasos y ROS y puede ser inhibido por nucleótidos de adenina (particularmente ADP), magnesio, protones y CsA 5,12. Se han dilucidado los mecanismos de acción de algunos de estos reguladores. El calcio mitocondrial desencadena la apertura de mPTP al menos en parte al unirse a la subunidad β de la ATP sintasa15. ROS puede activar el mPTP disminuyendo su afinidad por ADP y mejorando su afinidad por la ciclofilina D (CypD), el activador proteínico mPTP mejor estudiado16. El mecanismo de activación del mPTP por fosfato inorgánico y ácidos grasos es menos claro. En cuanto a los inhibidores endógenos, se cree que el ADP inhibe la mPTP al unirse a la ANT o ATP sintasa, mientras que el magnesio ejerce su efecto inhibitorio al desplazar el calcio de su sitio de unión 15,17,18,19.
El pH bajo inhibe la apertura de mPTP mediante la protonación de la histidina 112 de la subunidad reguladora de la proteína reguladora que confiere sensibilidad a la oligomicina (OSCP) de la ATP sintasa 12,20,21. El inhibidor farmacológico prototípico de la mPTP, CsA, actúa uniéndose a CypD e impidiendo su asociación con OSCP22,23. Trabajos previos también han demostrado que una variedad de análogos de CoQ interactúan con el mPTP, inhibiéndolo o activándolo24. En trabajos recientes, encontramos evidencia de una mPTP patológicamente abierta, fuga excesiva de protones y fosforilación oxidativa ineficiente debido a una deficiencia de CoQ en las mitocondrias del cerebro anterior de las crías de ratón recién nacidas con FXS25.
El cierre del poro con CoQ exógeno bloqueó la fuga patológica de protones e indujo la madurez morfológica de las espinas dendríticas25. Curiosamente, en los mismos animales, los cardiomiocitos FXS tenían niveles excesivos de CoQ y una probabilidad cerrada de mPTP en comparación con los controles de tipo salvaje26. Aunque se desconoce la causa de estas diferencias específicas de tejido en los niveles de CoQ, los hallazgos subrayan el concepto de que la CoQ endógena es probablemente un regulador clave de la mPTP. Sin embargo, existe una gran brecha en nuestro conocimiento porque el mecanismo de inhibición mediada por CoQ de la mPTP sigue siendo desconocido.
La regulación de la mPTP es un determinante crítico de la señalización celular y la supervivencia4. Por lo tanto, la detección de la apertura de mPTP dentro de las mitocondrias es clave cuando se consideran mecanismos fisiopatológicos específicos. Por lo general, el umbral para la apertura de poros de alta conductancia se determina utilizando calcio para desencadenar la transición de permeabilidad. Dicha carga de calcio conduce al colapso del potencial de membrana, al desacoplamiento rápido de la fosforilación oxidativa y a la hinchazón mitocondrial27,28. Se buscó desarrollar un método para detectar la apertura de mPTP de baja conductancia in situ, sin inducirla per se.
El enfoque explota el papel del mPTP como un canal de fuga de protones. Para ello, se emplearon electrodos selectivos de iones Tipo Clark y TPP+ para medir simultáneamente el consumo de oxígeno y el potencial de membrana, respectivamente, en mitocondrias aisladas durante la respiración por fuga29. El umbral para la apertura de mPTP se determinó por el inicio de la inhibición mediada por CsA de la fuga de protones en potenciales de membrana específicos. Utilizando este enfoque, se definieron con precisión las diferencias en la tensión de cierre del mPTP en el contexto del exceso de CoQ.
Este artículo describe un método para evaluar la probabilidad abierta de la mPTP. Específicamente, el umbral de voltaje para la apertura de mPTP de baja conductancia se determinó evaluando el efecto de la inhibición de CsA en la fuga de protones en un rango de ΔΨs. Usando esta técnica, pudimos identificar diferencias en la tensión de la mPTP entre ratones FXS y controles FVB consistentes con sus diferencias en el contenido de CoQ específico del tejido. Fundamental para el éxito de esta metodología es que las …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo está respaldado por las siguientes subvenciones: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Premio Target of Opportunity Provost del Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia al Departamento de Anestesiología (K.K.G.), Premio de Investigación del Joven Investigador de la Sociedad de Anestesia Pediátrica (K.K.G.) y NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |