שיטה זו מנצלת את התרומה של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדרית לדליפת פרוטונים בהולכה נמוכה כדי לקבוע את סף המתח לפתיחת נקבוביות בעכברי תסמונת X שבירים בילודים עם תכולת קו-אנזים Q מיטוכונדריאלית מוגברת של קרדיומיוציטים בהשוואה לבקרת wildtype.
נקבובית מעבר החדירות המיטוכונדרית (mPTP) היא ממברנה מיטוכונדריאלית פנימית מגודרת מתח, לא סלקטיבית ופנימית (IMM) בעלת תעלת ענק החשובה בבריאות ובמחלות. ה-mPTP מתווך דליפה של פרוטונים על פני ה-IMM במהלך פתיחת מוליכות נמוכה, והוא מעוכב באופן ספציפי על-ידי ציקלוספורין A (CsA). קו-אנזים Q (CoQ) הוא מווסת של ה-mPTP, והבדלים ספציפיים לרקמות נמצאו בתוכן ה-CoQ ובהסתברות הפתוחה של ה-mPTP במיטוכונדריה של המוח הקדמי והלב במודל עכבר שזה עתה נולד של תסמונת X שברירית (FXS, Fmr1 knockout). פיתחנו טכניקה לקביעת סף המתח של פתיחת mPTP בזן מוטנטי זה, תוך ניצול תפקידו של ה-mPTP כערוץ דליפת פרוטונים.
לשם כך, צריכת החמצן ופוטנציאל הממברנה (ΔΨ) נמדדו בו זמנית במיטוכונדריה מבודדת באמצעות פולרוגרפיה ואלקטרודה סלקטיבית יונים של טטרפניל פוספוניום (TPP+) במהלך נשימת דליפה. הסף לפתיחת mPTP נקבע על ידי הופעת עיכוב בתיווך CsA של דליפת פרוטונים בפוטנציאלים ספציפיים של ממברנה. באמצעות גישה זו, הבדלים בהאצת המתח של ה-mPTP הוגדרו במדויק בהקשר של עודף CoQ. טכניקה חדשנית זו תאפשר חקירה עתידית לשיפור ההבנה של רגולציה פיזיולוגית ופתולוגית של פתיחת מוליכות נמוכה של mPTP.
ה-mPTP מתווך את מעבר החדירות (PT), לפיו ה-IMM הופך להיות חדיר בפתאומיות למולקולות קטנות ומומס 1,2. תופעה בולטת זו היא סטייה מובהקת מהאטימות האופיינית של ה-IMM, שהיא בסיסית לביסוס השיפוע האלקטרוכימי הנחוץ לזרחון חמצוני3. PT, בניגוד למנגנוני הובלה מיטוכונדריאליים אחרים, הוא תהליך בעל מוליכות גבוהה, לא ספציפי ולא סלקטיבי, המאפשר מעבר של טווח מולקולות עד 1.5 kDa 4,5. ה-mPTP הוא ערוץ מגודר מתח בתוך ה-IMM שפתיחתו משנה את ΔΨ, ייצור ATP, הומאוסטזיס של סידן, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) וכדאיות תאים4.
בקיצוניות הפתולוגית, פתיחה בלתי מבוקרת וממושכת של מוליכות גבוהה של mPTP מובילה לקריסת השיפוע האלקטרוכימי, התנפחות מטריצה, דלדול של נוקלאוטידים של מטריצה פירידין, קרע בממברנה החיצונית, שחרור חלבונים אינטר-ממברניים (כולל ציטוכרום c), ובסופו של דבר, מוות תאי 4,6. פתיחת mPTP פתולוגית כזו הייתה מעורבת בפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה לבבית, אי ספיקת לב, פגיעה מוחית טראומטית, מחלות נוירודגנרטיביות שונות וסוכרת 1,7. עם זאת, פתיחת mPTP בהולכה נמוכה היא פיזיולוגית באופיה, ובניגוד לפתיחה בהולכה גבוהה, אינה מובילה לדה-פולריזציה עמוקה או לנפיחות מיטוכונדריאלית4.
פתיחה עם מוליכות נמוכה של הנקבובית מגבילה את החדירות לכ-300 Da, מאפשרת מעבר של פרוטונים ללא תלות בסינתזת ATP, ומהווה מקור פוטנציאלי לדליפת פרוטונים פיזיולוגית5. פתיחת mPTP פיזיולוגית גורמת לירידה מבוקרת ב-ΔΨ, מגבירה את שטף האלקטרונים דרך שרשרת ההובלה הנשימתית, וגורמת לפרץ קצר או הבזק של סופראוקסיד, מה שתורם לאותת ROS8. ויסות של פתיחת mPTP חולפת כזו חשוב להומאוסטזיס של סידן ולהתפתחות תקינה של התאיםולהבשלתם 4,9,10,11. פתיחת נקבוביות חולפת בתאי עצב מתפתחים, למשל, מעוררת התמיינות, בעוד שסגירת ה-mPTP גורמת להבשלה אצל קרדיומיוציטים לא בשלים 4,5.
למרות שהמשמעות התפקודית של ה-mPTP בבריאות ובמחלות מבוססת היטב, הזהות המולקולרית המדויקת שלו עדיין נתונה לוויכוח. ההתקדמות במבנה המולקולרי ובתפקוד של ה-mPTP נבדקה באופן מקיף במקום אחר12. בקצרה, נכון לעכשיו, ההשערה היא שמצבי מוליכות גבוהים ונמוכים של ה-mPTP מתווכים על ידי ישויות מובחנות12. המועמדים המובילים הם F1/F0 ATP סינתאז (ATP synthase) וטרנספורטר נוקלאוטידים אדנין (ANT) למצבי מוליכות גבוהה ונמוכה, בהתאמה12.
למרות חוסר ההסכמה לגבי הזהות המדויקת של המרכיב יוצר הנקבוביות של ה-mPTP, מפורטים מאפיינים מרכזיים מסוימים. תכונה מבוססת היטב של mPTP היא שהוא מווסת על ידי השיפוע האלקטרוכימי כך שדה-פולריזציה של ה- IMM מובילה לפתיחת נקבוביות13. עבודות קודמות הראו כי מצב החמצן מחדש של קבוצות תיול ויצינליות משנה את טמפרטורת המתח של ה-mPTP, כך שחמצון פותח את הנקבובית ב-ΔΨs גבוהים יחסית, והפחתת קבוצת תיול גורמת להסתברות mPTP סגורה14. עם זאת, זהותו של חיישן המתח החלבון אינה ידועה.
זוהו מולקולות קטנות שונות המווסתות את ההסתברות הפתוחה של הנקבובית. לדוגמה, ניתן לעורר את ה-mPTP להיפתח עם סידן, פוספט אנאורגני, חומצות שומן ו-ROS, והוא יכול להיות מעוכב על ידי נוקלאוטידים אדנין (במיוחד ADP), מגנזיום, פרוטונים ו-CsA 5,12. מנגנוני הפעולה של חלק מהרגולטורים הללו הובהרו. סידן מיטוכונדריאלי מפעיל את פתיחת ה-mPTP לפחות בחלקה על ידי קשירת תת-היחידה β של ה-ATP synthase15. ROS יכול להפעיל את ה-mPTP על ידי הפחתת הזיקה שלו ל-ADP והגברת הזיקה שלו לציקלופילין D (CypD), מפעיל ה-mPTP החלבון הנחקר ביותר16. מנגנון ההפעלה של mPTP על ידי פוספט אנאורגני וחומצות שומן הוא פחות ברור. באשר למעכבים אנדוגניים, ADP נחשב כמעכב את ה-mPTP על ידי קשירת ANT או ATP synthase, בעוד שמגנזיום מפעיל את השפעתו המעכבת על ידי הרחקת סידן מאתר הקישור שלו 15,17,18,19.
pH נמוך מעכב את פתיחת ה-mPTP על-ידי פרוטונציה של היסטידין 112 של תת-היחידה הרגולטורית של תת-היחידה המעניקה רגישות לאוליגומיצין (OSCP) של ה-ATP synthase 12,20,21. המעכב הפרמקולוגי האבטיפוסי של mPTP, CsA, פועל על ידי קשירת CypD ומניעת הקשר שלו עם OSCP22,23. עבודות קודמות הראו גם כי מגוון אנלוגים של CoQ מתקשרים עם mPTP, מעכבים אותו או מפעילים אותו24. בעבודה האחרונה מצאנו עדויות ל-mPTP פתוח פתולוגית, דליפת פרוטונים מוגזמת וזרחון חמצוני לא יעיל עקב מחסור ב-CoQ במיטוכונדריה קדמית של גורי עכברי FXS שזה עתה נולדו25.
סגירת הנקבובית עם CoQ אקסוגני חסמה את דליפת הפרוטונים הפתולוגיים וגרמה לבגרות מורפולוגית של עמודי שדרה דנדריטיים25. באופן מעניין, באותם בעלי חיים, קרדיומיוציטים של FXS היו בעלי רמות CoQ מוגזמות והסתברות mPTP סגורה בהשוואה לבקרות wildtype26. אף על פי שהסיבה להבדלים ספציפיים לרקמות אלה ברמות ה-CoQ אינה ידועה, הממצאים מדגישים את הרעיון ש-CoQ אנדוגני הוא ככל הנראה הרגולטור המרכזי של ה-mPTP. עם זאת, יש פער גדול בידע שלנו מכיוון שהמנגנון של עיכוב בתיווך CoQ של ה-mPTP עדיין אינו ידוע.
ויסות ה-mPTP הוא גורם מכריע באיתות התאובהישרדותו 4. לפיכך, גילוי פתיחת mPTP בתוך המיטוכונדריה הוא המפתח כאשר בוחנים מנגנונים פתופיזיולוגיים ספציפיים. בדרך כלל, הסף לפתיחת נקבוביות בעל מוליכות גבוהה נקבע באמצעות סידן כדי להפעיל את מעבר החדירות. העמסת סידן כזו מובילה לקריסת פוטנציאל הממברנה, לניתוק מהיר של זרחון חמצוני ולנפיחות מיטוכונדריאלית27,28. ביקשנו לפתח שיטה לאיתור פתיחת mPTP עם מוליכות נמוכה באתרה, מבלי לגרום לה כשלעצמה.
הגישה מנצלת את תפקידו של ה-mPTP כערוץ דליפת פרוטונים. לשם כך, נעשה שימוש באלקטרודות סלקטיביות מסוג קלארק ו-TPP+ כדי למדוד בו-זמנית את צריכת החמצן ואת פוטנציאל הממברנה, בהתאמה, במיטוכונדריה מבודדת במהלך נשימת דליפה29. הסף לפתיחת mPTP נקבע על ידי הופעת עיכוב בתיווך CsA של דליפת פרוטונים בפוטנציאלים ספציפיים של ממברנה. באמצעות גישה זו, הבדלים בהאצת המתח של mPTP בהקשר של עודף CoQ הוגדרו במדויק.
מאמר זה מתאר שיטה להערכת ההסתברות הפתוחה של ה- mPTP. באופן ספציפי, סף המתח לפתיחת mPTP בהולכה נמוכה נקבע על ידי הערכת ההשפעה של עיכוב CsA על דליפת פרוטונים בטווח של ΔΨs. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לזהות הבדלים בהאצת המתח של ה-mPTP בין עכברי FXS לבקרות FVB התואמים את ההבדלים ביניהם בתכולת ה-CoQ הספציפית…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), פרס המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה אירווינג יעד ההזדמנות למחלקה להרדמה (K.K.G.), פרס מחקר החוקר הצעיר של האגודה להרדמה בילדים (K.K.G.), ו- NIH/NINDS R01NS1112706 (R.J.L.)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |