هندسة وتوصيف نموذج بصري وراثي للوصلة العصبية العضلية البشرية
Summary
نحن نصف نظام تصوير قابل للتكرار ومؤتمت وغير متحيز لتوصيف وظيفة الوصلة العصبية العضلية باستخدام الأنسجة العضلية الهيكلية البشرية المهندسة والخلايا العصبية الضوئية الوراثية. يسمح هذا النظام بالقياس الكمي الوظيفي للاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت ويكتشف تناقص الوظيفة العصبية العضلية الناجمة عن السموم العصبية والوهن العضلي الوبيل مصل المريض.
Abstract
ترتبط العديد من الأمراض العصبية العضلية ، مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) ، بخلل وظيفي في الوصلة العصبية العضلية (NMJ) ، والتي يصعب توصيفها في النماذج الحيوانية بسبب الاختلافات الفسيولوجية بين الحيوانات والبشر. توفر هندسة الأنسجة فرصا لتوفير نماذج في المختبر من NMJs البشرية الوظيفية التي يمكن استخدامها لتشخيص والتحقيق في أمراض NMJ واختبار العلاجات المحتملة. من خلال دمج البروتينات البصرية الجينية في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، قمنا بتوليد الخلايا العصبية التي يمكن تحفيزها بأطوال موجية محددة من الضوء. إذا كان NMJ صحيا ووظيفيا ، فإن الإشارة الكيميائية العصبية من motoneuron تؤدي إلى تقلص العضلات. من خلال دمج علم البصريات الوراثي والتصنيع الدقيق مع هندسة الأنسجة ، أنشأنا منهجية غير متحيزة وآلية لتوصيف وظيفة NMJ باستخدام تحليل الفيديو. تم تطوير بروتوكول موحد لتشكيل NMJ ، والتحفيز البصري مع تسجيل الفيديو في وقت واحد ، وتحليل الفيديو لانقباض الأنسجة. تحفيز الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية عن طريق الضوء للحث على تقلصات العضلات الهيكلية يلخص فسيولوجيا NMJ البشرية ويسمح بالقياسات الوظيفية المتكررة ل NMJ بمرور الوقت واستجابة للمدخلات المختلفة. نحن نظهر قدرة هذه المنصة على إظهار التحسينات الوظيفية في الاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت وتوصيف الآثار الضارة للأجسام المضادة MG للمريض أو السموم العصبية على وظيفة NMJ.
Introduction
التقاطع العصبي العضلي (NMJ) هو المشبك الكيميائي بين الخلايا العصبية المتحركة (MNs) وخلايا العضلات الهيكلية (SkM) التي تسمح بتقلص العضلات. السموم ، مثل السموم العصبية α بونغاروتوكسين (BTX) ، أو الأمراض العصبية العضلية (NMD) مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) يمكن أن تؤدي إلى انحطاط NMJ وانخفاض في السيطرة على العضلات1. تلخص نماذج الأنسجة البشرية المهندسة بيولوجيا بشكل أفضل الآليات الوظيفية والفسيولوجية ل NMJs البشرية وتوفر إمكانات انتقالية أكبر من النماذج الحيوانية.
في حين أن النماذج الحيوانية قد تقدمت في فهم تكوين ووظيفة NMJ ، هناك اختلافات كبيرة بين نقاط الاشتباك العصبي البشرية والحيوانية التي تحد من ترجمة النتائج إلى البشر وتجعل في الجسم الحي توصيف NMJ تحديا2،3،4. وقد أظهرت الدراسات اختلافات فسيولوجية متميزة بين NMJs الفئران والإنسان. الفئران لديها NMJs أكبر وكثافات منطقة نشطة أصغر بالمقارنة مع NMJs البشرية4. بالإضافة إلى ذلك ، لا تعكس دراسات الأدوية التي أجريت في النماذج الحيوانية دائما الآثار الموجودة في التجارب السريرية البشرية. توفر نماذج الأنسجة البشرية الهندسية الفرصة لدراسة التطور الصحي ل NMJ وأمراض الأمراض العصبية العضلية والسماح بإجراء فحوصات الأدوية. يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs)5 إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا العضلات الهيكلية 6,7 والخلايا العصبية المتحركة 8,9. يمكن توليد hiPSCs بسهولة من خلايا المريض ، مما يسمح بنمذجة أفضل للأمراض10 وفحص الأدوية11,12 من خلال نماذج الأنسجة الخاصة بالمريض.
تفتقر الثقافات المشتركة ثنائية الأبعاد (2D) أحادية الطبقة من SkMs و MNs إلى المورفولوجيا والنمط الظاهري والتنظيم والسلوك الوظيفي ل NMJs الفسيولوجية. NMJs تتشكل بشكل عشوائي في ثقافة ثنائية الأبعاد ، مما يمنع عزل الوحدات الحركية للتحليل ، ويحد من القياسات الوظيفية الدقيقة ، ويمنع استخدامها للتجارب المتكررة والمنهجية13 . تتغلب نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D) من NMJs على العديد من هذه القيود ، وتلخص الخصائص المورفولوجية والوظيفية ل NMJs الفسيولوجية7،14،15،16،17. باستخدام هذا النموذج ، يتم تطوير نوعي الأنسجة بشكل منفصل ثم يتم دمجهما عن طريق توجيه النمو المحوري ، مما يسمح بتطوير NMJs أكثر تنظيما مقارنة بأنظمة زراعة 2D.
أظهرت دراستنا السابقة أن الجمع بين علم البصريات الوراثي وهندسة الأنسجة يمكن أن يسمح بالتحفيز الدقيق غير الغازي وتقييم وظيفة NMJ18,19. من خلال الهندسة الوراثية ، يمكن دمج البروتينات الحساسة للضوء في جينوم hiPSCs. إن دمج قناة رودوبسين-2 (ChR2) ، وهي قناة أيونية تفتح استجابة للضوء الأزرق ، في غشاء الخلايا القابلة للإثارة مثل الخلايا العصبية يسمح بالتحكم الزماني المكاني غير المتصل في تنشيط الخلية 20،21،22. يمكن تمييز hiPSCs التي تحمل ChR2 إلى خلايا عصبية حركية بصرية حساسة للضوء الأزرق ، مما يزيل الحاجة إلى أقطاب كهربائية غازية نموذجية تحفز الخلايا العصبية وتجنب التحفيز غير المرغوب فيه لخلايا العضلات بواسطة الأقطاب الكهربائية23. يستخدم هذا النظام الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية لتحفيز الانقباضات في خلايا العضلات الهيكلية غير البصرية الوراثية. يسمح الجمع بين الحصول على الفيديو وإضاءة الضوء الأزرق التي يتم التحكم فيها بتحفيز الأنسجة المستزرعة وتسجيلها في وقت واحد لوظيفة NMJ.
يحدث MG بسبب الأجسام المضادة الذاتية التي تستهدف مستقبلات أستيل كولين النيكوتينية (AChR) ، مما يؤدي إلى انخفاض وظيفة NMJ وضعف العضلات24. يتم تشخيصه بناء على الأعراض المقدمة والتشخيص الكهربائي والكشف عن الأجسام المضادة الذاتية عن طريق اختبارات الدم المصلية. ومع ذلك ، لم يتم تحديد جميع الأجسام المضادة الذاتية المشاركة في MG ، ويتم تشخيص بعض المرضى سلبيي المصل مع MG ولكن مع عدم وجود أجسام مضادة معترف بها25,26. يسمح نظامنا بإجراء تقييم وظيفي متكرر ل NMJ قبل وبعد إضافة المصل من مرضى MG ، مما يوفر نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن على التغيرات الوظيفية والكيميائية الحيوية التي تسببها الأجسام المضادة MG18. يوضح بروتوكولنا كيفية إنتاج نماذج 3D في المختبر من NMJ البشري الوظيفي الذي يمكن استخدامه لتشخيص أمراض NMJ والتحقيق فيها واختبار العلاجات المحتملة. نحن نظهر براعة النظام في منصتين ، جهاز الموائع الدقيقة ، ومنصة مفاعل حيوي أكبر مفتوحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا النظام هو نموذج الأنسجة البشرية 3D هندسيا الذي يجمع بين علم البصريات ومعالجة الفيديو لتمكين التقييم الآلي وغير المتحيز لوظيفة NMJ. باستخدام بروتوكول موحد ، أثبتنا القدرة على قياس التغيرات في وظيفة NMJ أثناء التطور الفسيولوجي وتوصيف الآثار الضارة للأمراض مثل التعرض للسموم العصبية والوهن…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر بامتنان الدعم التمويلي المقدم من المعاهد الوطنية للصحة [أرقام المنح EB025765 و EB027062] ، ووزارة الدفاع [رقم الجائزة W81XWH-18-1-0095] ، و UCSF Health Innovation via Engineering (زمالة فيروس نقص المناعة البشرية). نحن نقدر بامتنان مركز الخلايا الجذعية بجامعة كولومبيا لمساعدته وتوجيهه في إعادة برمجة الخلايا.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
Referencias
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
- Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
- Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
- Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
- Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
- Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
- Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
- Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
- Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).
