Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana
Summary
Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.
Abstract
Muchas enfermedades neuromusculares, como la miastenia gravis (MG), están asociadas con la disfunción de la unión neuromuscular (NMJ), que es difícil de caracterizar en modelos animales debido a las diferencias fisiológicas entre animales y humanos. La ingeniería de tejidos ofrece oportunidades para proporcionar modelos in vitro de NMJ humanos funcionales que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Al incorporar proteínas optogenéticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC), generamos neuronas que pueden ser estimuladas con longitudes de onda específicas de luz. Si el NMJ es saludable y funcional, una señal neuroquímica de la motoneurona resulta en la contracción muscular. A través de la integración de la optogenética y la microfabricación con la ingeniería de tejidos, establecimos una metodología imparcial y automatizada para caracterizar la función NMJ utilizando el análisis de video. Se desarrolló un protocolo estandarizado para la formación de NMJ, la estimulación óptica con grabación de video simultánea y el análisis de video de la contractilidad del tejido. La estimulación de motoneuronas optogenéticas por la luz para inducir contracciones del músculo esquelético recapitula la fisiología humana de NMJ y permite mediciones funcionales repetidas de NMJ a lo largo del tiempo y en respuesta a diversas entradas. Demostramos la capacidad de esta plataforma para mostrar mejoras funcionales en la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y caracterizar los efectos dañinos de los anticuerpos MG o neurotoxinas del paciente en la función NMJ.
Introduction
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis química entre las motoneuronas (MN) y las células del músculo esquelético (SkM) que permite la contracción muscular. Las toxinas, como la neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), o las enfermedades neuromusculares (NMD) como la miastenia gravis (MG) pueden conducir a la degeneración de la NMJ y reducciones en el control muscular1. Los modelos de tejidos humanos de bioingeniería recapitulan mejor los mecanismos funcionales y fisiológicos de los NMJ humanos y ofrecen un mayor potencial de traducción que los modelos animales.
Si bien los modelos animales han avanzado en la comprensión de la formación y función del NMJ, existen diferencias significativas entre las sinapsis humanas y animales que limitan la traducción de los resultados a los humanos y hacen que la caracterización in vivo del NMJ sea un desafío 2,3,4. Los estudios han demostrado diferencias fisiológicas distintas entre los NMJ de ratón y humanos. Los ratones tienen NMJ más grandes y densidades de zona activa más pequeñas en comparación con los NMJ humanos4. Además, los estudios de medicamentos realizados en modelos animales no siempre reflejan los efectos encontrados en los ensayos clínicos en humanos. Los modelos de tejido humano diseñados brindan la oportunidad de estudiar el desarrollo saludable de la NMJ y la patología de las enfermedades neuromusculares y permiten la detección de drogas. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs)5 se pueden diferenciar en una variedad de tipos de células, incluidas las células del músculo esquelético 6,7 y las motoneuronas 8,9. Las hiPSC se pueden generar fácilmente a partir de células de pacientes, lo que permite un mejor modelado de la enfermedad10 y la detección de fármacos11,12 a través de modelos de tejido específicos del paciente.
Los cocultivos monocapa bidimensionales (2D) de SkMs y MNs carecen de la morfología, fenotipo, organización y comportamiento funcional de los NMJ fisiológicos. Los NMJ se forman aleatoriamente en cultivo 2D, lo que inhibe el aislamiento de unidades motoras para su análisis, limita las mediciones funcionales precisas e impide su uso para experimentos repetidos y sistemáticos13 . Los modelos tisulares tridimensionales (3D) de NMJ superan muchas de estas limitaciones, recapitulando las características morfológicas y funcionales de los NMJ fisiológicos 7,14,15,16,17. Usando este modelo, los dos tipos de tejido se desarrollan por separado y luego se integran dirigiendo el crecimiento axonal, lo que permite que se desarrollen NMJ más organizados en comparación con los sistemas de cultivo 2D.
Nuestro estudio anterior demostró que la combinación de optogenética con ingeniería de tejidos puede permitir una estimulación no invasiva precisa y una evaluación de la función NMJ18,19. A través de la ingeniería genética, las proteínas sensibles a la luz se pueden integrar en el genoma de las hiPSC. La integración de la canalrodopsina-2 (ChR2), un canal iónico que se abre en respuesta a la luz azul, en la membrana de células excitables como las neuronas permite el control espaciotemporal sin contacto sobre la activación celular 20,21,22. Las hiPSC que transportan ChR2 se pueden diferenciar en motoneuronas optogenéticas sensibles a la luz azul, eliminando la necesidad de electrodos invasivos típicos que estimulan las neuronas y evitando la estimulación no deseada de las células musculares por electrodos23. Este sistema utiliza motoneuronas optogenéticas para estimular las contracciones en las células del músculo esquelético no optogenético. La combinación de la adquisición de video y la iluminación controlada de luz azul permite que los tejidos cocultivados se estimulen y graben simultáneamente para la función NMJ.
La MG es causada por autoanticuerpos dirigidos a los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChR), lo que resulta en una disminución de la función NMJ y debilidad muscular24. Se diagnostica en función de los síntomas presentados, el electrodiagnóstico y la detección de autoanticuerpos a través de análisis de sangre serológicos. Sin embargo, no se han identificado todos los autoanticuerpos implicados en la MG, y algunos pacientes seronegativos son diagnosticados con MG pero sin anticuerpos reconocidos25,26. Nuestro sistema permite la evaluación funcional repetida de la NMJ antes y después de la adición de suero de pacientes con MG, proporcionando información invaluable sobre los cambios funcionales y bioquímicos causados por los anticuerpos MG18. Nuestro protocolo ilustra cómo producir modelos 3D in vitro de NMJ humana funcional que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Demostramos la versatilidad del sistema en dos plataformas, un dispositivo microfluídico y una plataforma de biorreactor de pozo abierto más grande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este sistema es un modelo de tejido humano 3D diseñado que combina optogenética y procesamiento de video para permitir una evaluación automatizada e imparcial de la función NMJ. Utilizando un protocolo estandarizado, hemos demostrado la capacidad de medir los cambios en la función de NMJ durante el desarrollo fisiológico y caracterizar los efectos dañinos de patologías como la exposición a neurotoxinas y los sueros de pacientes con miastenia gravis.
Estudios previos han reportado la c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo financiero de los NIH [números de subvención EB025765 y EB027062], el DOD [número de premio W81XWH-18-1-0095] y la UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Agradecemos al Núcleo de Células Madre de la Universidad de Columbia por su ayuda y orientación con la reprogramación celular.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
Referencias
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