Mikrofluidisches Gerät zur Trennung von nicht-metastasierten (MCF-7) und nicht-tumoralen (MCF-10A) Brustkrebszellen mittels AC-Dielektrophorese

Summary

Brustkrebszellen zeigen unterschiedliche dielektrische Eigenschaften im Vergleich zu Nicht-Tumor-Brustepithelzellen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass aufgrund dieses Unterschieds in den dielektrischen Eigenschaften die beiden Populationen für Immuntherapiezwecke getrennt werden können. Um dies zu unterstützen, modellieren wir ein mikrofluidisches Gerät zur Sortierung von MCF-7- und MCF-10A-Zellen.

Abstract

Dielektrophoretische Geräte sind in der Lage, Krebszellen markierungsfrei, kostengünstig, robust und genau nach dem Prinzip der Polarisation der Krebszellen im Probenvolumen durch Anlegen eines externen elektrischen Feldes zu detektieren und zu manipulieren. Dieser Artikel zeigt, wie eine mikrofluidische Plattform für die kontinuierliche Hochdurchsatzsortierung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) unter Verwendung hydrodynamischer Dielektrophorese (HDEP) aus der Zellmischung verwendet werden kann. Durch die Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen zwei Elektroden, die nebeneinander mit einem mikrometergroßen Spalt zwischen ihnen in einem mikrofluidischen HDEP-Chip angeordnet sind, können Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) weggedrückt werden, die im Hauptkanal eine negative DEP aufweisen, während die nicht-metastasierten Brustkrebszellen ihrem Verlauf unbeeinflusst folgen, wenn sie im Zellmedium suspendiert sind, da die Leitfähigkeit höher ist als die Membranleitfähigkeit. Um dieses Konzept zu demonstrieren, wurden Simulationen für verschiedene Werte der Medienleitfähigkeit durchgeführt und die Sortierung von Zellen untersucht. Eine parametrische Studie wurde durchgeführt, und eine geeignete Zellmischungsleitfähigkeit wurde mit 0,4 S / m gefunden. Durch Festhalten der Medienleitfähigkeit wurde eine adäquate Wechselstromfrequenz von 0,8 MHz hergestellt, die durch Variation der elektrischen Feldfrequenz eine maximale Sortiereffizienz ergibt. Unter Verwendung des demonstrierten Verfahrens kann nach Auswahl des geeigneten Zellmischsuspensionsmediums Leitfähigkeit und Frequenz des angelegten AC eine maximale Sortiereffizienz erreicht werden.

Introduction

Ein bösartiger Tumor, der sich in und um das Brustgewebe entwickelt, ist eine häufige Ursache für Brustkrebs bei Frauen weltweit und verursacht ein kritisches Gesundheitsproblem¹. Brusttumoren vor Metastasen können durch eine Operation behandelt werden, wenn sie in einem frühen Stadium erkannt werden, aber wenn sie ignoriert werden, können sie schwerwiegende Auswirkungen auf das Leben des Patienten haben, indem sie sich auf Lunge, Gehirn und Knochen ausbreiten. Die Behandlungen, die in späteren Stadien angeboten werden, wie Bestrahlung und chemische Therapien, haben schwere Nebenwirkungen². Neuere Studien haben berichtet, dass eine frühzeitige Diagnose von Brustkrebs die Sterblichkeitsrate um 60% ^senkt3. Daher ist es unerlässlich, auf personalisierte Früherkennungsmethoden hinzuarbeiten. Zu diesem Zweck haben Forscher aus verschiedenen Bereichen der Wissenschaft und Technologie die Mikrofluidik genutzt, um Geräte zur Früherkennung von Brustkrebs zu entwickeln⁴. Zu diesen Methoden gehören Zellaffinitätsmikrochromatographie, magnetisch aktivierte Mikrozellsortierer, größenbasierte Krebszellerfassung und -trennung sowie On-Chip-Dielektrophorese (DEP)^5,6. Diese in der Literatur beschriebenen mikrofluidischen Techniken ermöglichen eine präzise Zellmanipulation, Echtzeitüberwachung und Sortierung genau definierter Proben, die als Zwischenschritt in vielen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen dienen⁵. Die Integration dieser Sortiermechanismen mit der Mikrofluidik ermöglicht eine flexible und zuverlässige Manipulation der Zielzellen 7,8,9,10. Einer der Hauptvorteile einer solchen Integration ist die Möglichkeit, mit flüssigen Proben in Nano- bis Mikrolitervolumina zu arbeiten und auch die elektrischen Eigenschaften der Probenflüssigkeit manipulieren zu können. Durch Einstellung der Leitfähigkeit der suspendierenden Flüssigkeit in mikrofluidischen Vorrichtungen können die biologischen Zellen nach ihrer Größe und Unterschieden in ihren dielektrischen Eigenschaften sortiert werden^11,12.

Unter diesen Techniken wird häufig die On-Chip-DEP bevorzugt, da es sich um eine markierungsfreie Zellsortiertechnik handelt, die die elektrischen Eigenschaften der biologischen Proben nutzt. Es wurde berichtet, dass DEP Bioproben wie DNA 13, RNA 14, Proteine 15, Bakterien¹⁶, Blutzellen 17, zirkulierende Tumorzellen (CTCs)18 und Stammzellen ¹⁹ manipuliert. Mikrofluidische Geräte, die DEP zur Sortierung biologischer Proben verwenden, wurden in der Literatur^{ausführlich berichtet 20}. Es wurde über reservoirbasierte DEP-Mikrofluidik-Geräte (rDEP) zur Sortierung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Hefezellen berichtet, die die Zellen vor den nachteiligen Auswirkungen elektrochemischer Reaktionen schützen^21,22. Piacentini et al. berichteten über einen zinnenförmigen mikrofluidischen Zellsortierer, der rote Blutkörperchen von Blutplättchen mit einer Effizienz von 97% ^trennte23. Es wurde auch berichtet, dass On-Chip-DEP-Geräte mit asymmetrischen Öffnungen und eingebetteten Elektroden lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen sortieren²⁴. Valero und Demierre et al. modifizierten den kastellierten mikrofluidischen Zellsortierer, indem sie zwei Arrays von Mikroelektroden auf beiden Seiten des Kanals^25,26 einführten. Dies half bei der Fokussierung der Zellen in der Mitte des Kanals. Zeynep et al. präsentierten ein DEP-basiertes mikrofluidisches Gerät zur Trennung und Konzentration von MCF7-Brustkrebszellen aus Leukozyten²⁷. Sie berichteten über eine Effizienz bei der Extraktion von MCF7-Zellen aus Leukozyten zwischen 74% -98% mit einer Frequenz von 1 MHz und einer angelegten Spannung von 10-12 V_pp. Die ergänzende Tabelle 1 stellt einen qualitativen und quantitativen Vergleich zwischen den DEP-basierten mikrofluidischen Sortiergeräten anhand ihres Designs, ihrer Elektrodenkonfiguration und ihrer Betriebsparameter (angelegte Frequenz und Spannung) dar.

In jüngerer Zeit haben Forscher versucht, die Unterschiede im dielektrischen Verhalten von Brustepithelzellen (MCF-10A) und nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) in einem mikrofluidischen Chip^28,29 zu messen. Jithin et al. charakterisierten auch die dielektrischen Reaktionen verschiedener Krebszelllinien mit einer offenen koaxialen Sondentechnik mit Frequenzen zwischen 200 MHz und 13,6 GHz³⁰. Diese Unterschiede in den dielektrischen Antworten von MCF-7- und MCF-10A-Zelllinien können ausgenutzt werden, um sie in der Laufzeit zu trennen und zur Entwicklung personalisierter Frühdiagnosegeräte zu führen.

In diesem Artikel simulieren wir die kontrollierte Sortierung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und nicht-tumoralen Brustepithelzellen (MCF-10A) mittels AC-Dielektrophorese. Der Bereich der Änderung des elektrischen Feldes beeinflusst die Sortierung innerhalb des mikrofluidischen Chips. Die vorgeschlagene Technik ist einfach zu implementieren und ermöglicht die Integration der Sortiertechnik in verschiedene mikrofluidische Chiplayouts. Computational Fluid Dynamics (CFD) Simulationen wurden durchgeführt, um die Trennung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen zu untersuchen, indem die Leitfähigkeit des flüssigen Mediums, in dem Zellen suspendiert waren, variiert wurde. In diesen Simulationen wird gezeigt, dass durch konstante Leitfähigkeit und durch Veränderung der angelegten Frequenz die Trennung von Krebszellen und gesunden Zellen gesteuert werden kann.

Protocol

HINWEIS: Das Protokoll hier verwendet COMSOL, eine Multiphysik-Simulationssoftware, um die kontrollierte Sortierung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) mittels AC-Dielektrophorese zu simulieren. 1. Chipdesign und Parameterauswahl Öffnen Sie die Multiphysik-Software und wählen Sie Leeres Modell. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die globalen Definitionen und wählen …

Representative Results

Untersuchung der optimalen operativen Parameter für eine effektive DEP-basierte Sortierung von nicht-metastasierten Brustkrebs- (MCF-7) und nicht-tumoralen Brustepithelzellen (MCF-10A)Um eine erfolgreiche Trennung von nicht-metastasierendem Brustkrebs (MCF-7) und nicht-tumoralem Brustepithel (MCF-10A) Zellen mit divergenten dielektrischen Eigenschaften während der Dielektrophorese zu erreichen, sollten ihre K-Faktoren unterschieden werden, indem die angewandte Frequenzfest 37,38</…

Discussion

Mikrofluidische Geräte wurden zuvor für Zellkultur, Fangen und Sortieren berichtet 47,52,53. Die Herstellung dieser Geräte im Reinraum ist ein teurer Prozess, und es ist unerlässlich, die Leistung und Effizienz eines vorgeschlagenen mikrofluidischen Geräts durch CFD-Simulationen zu quantifizieren. Diese Studie präsentiert das Design und die Simulationen eines AC-dielektrophoretischen mikrofluidischen Geräts zur kontinuier…

Materials

COMSOL

COMSOL

multiphysics simulation software