Dispositivo microfluidico per la separazione di cellule di cancro al seno non metastatiche (MCF-7) e non tumorali (MCF-10A) mediante dielettroforesi AC

Summary

Le cellule del cancro al seno presentano proprietà dielettriche diverse rispetto alle cellule epiteliali mammarie non tumorali. È stato ipotizzato che, sulla base di questa differenza di proprietà dielettriche, le due popolazioni possano essere separate ai fini dell’immunoterapia. Per supportare questo, modelliamo un dispositivo microfluidico per ordinare le celle MCF-7 e MCF-10A.

Abstract

I dispositivi dielettroforetici sono in grado di rilevare e manipolare le cellule tumorali in modo privo di etichette, economico, robusto e accurato utilizzando il principio della polarizzazione delle cellule tumorali nel volume del campione applicando un campo elettrico esterno. Questo articolo dimostra come una piattaforma microfluidica può essere utilizzata per lo smistamento continuo ad alto rendimento di cellule di cancro al seno non metastatico (MCF-7) e cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) utilizzando la dielettroforesi idrodinamica (HDEP) dalla miscela cellulare. Generando un campo elettrico tra due elettrodi posti fianco a fianco con uno spazio di dimensioni micron tra loro in un chip microfluidico HDEP, le cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) possono essere allontanate, esibendo DEP negativo all’interno del canale principale, mentre le cellule di cancro al seno non metastatico seguono il loro decorso inalterate quando sospese nel mezzo cellulare a causa della conduttività superiore alla conduttività della membrana. Per dimostrare questo concetto, sono state eseguite simulazioni per diversi valori di media conduttività ed è stato studiato lo smistamento delle celle. È stato condotto uno studio parametrico ed è risultata una conduttività della miscela cellulare adatta a 0,4 S/m. Mantenendo fissa la conducibilità del mezzo, è stata stabilita un’adeguata frequenza CA di 0,8 MHz, dando la massima efficienza di ordinamento, variando la frequenza del campo elettrico. Utilizzando il metodo dimostrato, dopo aver scelto la conduttività e la frequenza della media di sospensione della miscela cellulare appropriata dell’AC applicata, è possibile ottenere la massima efficienza di selezione.

Introduction

Un tumore maligno che si sviluppa dentro e intorno al tessuto mammario è una causa frequente di cancro al seno nelle donne di tutto il mondo, causando un problema di salute critico¹. I tumori al seno prima delle metastasi possono essere trattati chirurgicamente se rilevati in una fase precoce, ma se ignorati, possono avere gravi implicazioni sulla vita del paziente diffondendosi ai polmoni, al cervello e alle ossa. I trattamenti offerti nelle fasi successive, come le radiazioni e le terapie a base chimica, hanno gravi effetti collaterali². Studi recenti hanno riportato che una diagnosi precoce di cancro al seno riduce il tasso di mortalità del 60%³. Quindi, è imperativo lavorare verso metodi di diagnosi precoce personalizzati. A tal fine, ricercatori che lavorano in diversi campi della scienza e della tecnologia hanno utilizzato la microfluidica per sviluppare dispositivi per la diagnosi precoce del cancro al seno⁴. Questi metodi includono microcromatografia ad affinità cellulare, selezionatori di microcellule attivati magneticamente, cattura e separazione delle cellule tumorali basate sulle dimensioni e dielettroforesi su chip (DEP)^5,6. Queste tecniche microfluidiche riportate in letteratura consentono una manipolazione cellulare precisa, il monitoraggio in tempo reale e lo smistamento di campioni ben definiti, che fungono da passaggio intermedio in molte applicazioni diagnostiche e terapeutiche⁵. L’integrazione di questi meccanismi di selezione con la microfluidica offre una manipolazione flessibile e affidabile delle cellule bersaglio 7,8,9,10. Uno dei principali vantaggi di tale integrazione è la capacità di lavorare con campioni di fluido in volumi da nano a microlitri e anche di essere in grado di manipolare le proprietà elettriche del fluido campione. Regolando la conduttività del fluido sospeso all’interno di dispositivi microfluidici, le cellule biologiche possono essere ordinate in base alle loro dimensioni e alle differenze nelle loro proprietà dielettriche^11,12.

Tra queste tecniche, il DEP su chip è spesso preferito in quanto è una tecnica di selezione cellulare label-free che sfrutta le proprietà elettriche dei campioni biologici. È stato segnalato che il DEP manipola campioni biologici come DNA 13, RNA 14, proteine 15, batteri 16, cellule del sangue¹⁷, cellule tumorali circolanti (CTC) 18 e cellule staminali ¹⁹. I dispositivi microfluidici che impiegano DEP per la selezione di campioni biologici sono stati ampiamente riportati nella letteratura²⁰. Sono stati segnalati dispositivi microfluidici DEP (rDEP) basati su serbatoi per la selezione di cellule di lievito vitali e non vitali che proteggono le cellule dagli effetti avversi delle reazioni elettrochimiche^21,22. Piacentini et al. hanno riportato un selezionatore di cellule microfluidiche castellate che separava i globuli rossi dalle piastrine con un’efficienza del 97% ²³. Sono stati segnalati anche dispositivi DEP su chip con orifizi asimmetrici ed elettrodi incorporati per ordinare celle vitali e non vitali²⁴. Valero e Demierre et al. hanno modificato la selezionatrice di cellule microfluidiche castellate introducendo due array di microelettrodi su entrambi i lati del canale^25,26. Ciò ha aiutato a focalizzare le celle al centro del canale. Zeynep et al. hanno presentato un dispositivo microfluidico basato su DEP per separare e concentrare le cellule di cancro al seno MCF7 dai leucociti²⁷. Hanno riportato un’efficienza nell’estrazione di cellule MCF7 dai leucociti tra il 74% e il 98% con una frequenza di 1 MHz e una tensione applicata compresa tra 10-12 V_pp. La tabella supplementare 1 rappresenta un confronto qualitativo e quantitativo tra i dispositivi di selezione microfluidica basati su DEP in base al loro design, alla configurazione degli elettrodi e ai parametri operativi (frequenza e tensione applicate).

Più recentemente, i ricercatori hanno cercato di misurare le differenze nel comportamento dielettrico delle cellule epiteliali del seno (MCF-10A) e delle cellule di cancro al seno non metastatico (MCF-7) all’interno di un chip microfluidico^28,29. Jithin et al. hanno anche caratterizzato le risposte dielettriche di diverse linee cellulari tumorali utilizzando una tecnica di sonda coassiale aperta con frequenze comprese tra 200 MHz e 13,6 GHz³⁰. Queste differenze nelle risposte dielettriche delle linee cellulari MCF-7 e MCF-10A possono essere sfruttate per separarle in fase di esecuzione e possono portare allo sviluppo di dispositivi personalizzati di diagnosi precoce.

In questo articolo, simuliamo l’ordinamento controllato delle cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) utilizzando la dielettroforesi AC. La regione di cambiamento nel campo elettrico influenza lo smistamento all’interno del chip microfluidico. La tecnica proposta è facile da implementare e consente l’integrazione della tecnica di selezione in vari layout di chip microfluidici. Sono state effettuate simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) per studiare la separazione delle cellule di carcinoma mammario non metastatico e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali variando la conduttività del mezzo fluido in cui le cellule sono state sospese. In queste simulazioni, è dimostrato che, mantenendo costante la conducibilità e modificando la frequenza applicata, la separazione delle cellule tumorali e delle cellule sane può essere controllata.

Protocol

NOTA: Il protocollo qui utilizza COMSOL, un software di simulazione multifisica, per simulare l’ordinamento controllato delle cellule di cancro al seno non metastatiche (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) utilizzando la dielettroforesi AC. 1. Progettazione del chip e selezione dei parametri Aprire il software multifisico e selezionare Modello vuoto. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Definizioni globa…

Representative Results

Studiare i parametri operativi ottimali per un efficace ordinamento basato su DEP delle cellule epiteliali mammarie non metastatiche (MCF-7) e non tumorali (MCF-10A)Per ottenere una separazione di successo del carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) con proprietà dielettriche divergenti quando sottoposte a dielettroforesi, i loro fattori K dovrebbero essere distinti mantenendo la frequenza applicata fissa37,38…

Discussion

Dispositivi microfluidici sono stati descritti in precedenza per la coltura cellulare, l’intrappolamento e lo smistamento 47,52,53. La fabbricazione di questi dispositivi in camera bianca è un processo costoso ed è imperativo quantificare l’output e l’efficienza di un dispositivo microfluidico proposto attraverso simulazioni CFD. Questo studio presenta la progettazione e le simulazioni di un dispositivo microfluidico AC-dielet…

Materials

COMSOL

COMSOL

multiphysics simulation software