Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus
Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.
Abstract
Blasenkrebs ist ein wenig untersuchter Bereich, insbesondere in gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs). Inzucht-GEMMs mit gewebespezifischen Cre- und loxP-Stellen waren die Goldstandards für bedingtes oder induzierbares Gen-Targeting. Um schnellere und effizientere experimentelle Modelle zu liefern, wird ein Ex-vivo-Organoid-Kultursystem entwickelt, das das Adenovirus Cre und normale Urothelzellen verwendet, die mehrere loxP-Allele der Tumorsuppressoren Trp53, Pten und Rb1 tragen. Normale Urothelzellen sind enzymatisch von vier Blasen dreifach floxierter Mäuse getrennt (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). Die Urothelzellen werden ex vivo mit Adenovirus-Cre transduziert, das von einem CMV-Promotor (Ad5CMVCre) angetrieben wird. Die transduzierten Blasenorganoide werden in vitro und in vivo kultiviert, vermehrt und charakterisiert. Die PCR wird verwendet, um Gendeletionen in Trp53, Pten und Rb1 zu bestätigen. Die Immunfluoreszenz-Färbung (IF) von Organoiden zeigt eine positive Expression von Urothellinienmarkern (CK5 und p63). Die Organoide werden subkutan in Wirtsmäuse injiziert, um Tumorexpansion und serielle Passagen zu erhalten. Die Immunhistochemie (IHC) von Xenotransplantaten zeigt eine positive Expression von CK7, CK5 und p63 und eine negative Expression von CK8 und Uroplakin 3. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Adenovirus-vermittelte Gendeletion aus Urothelzellen der Maus, die mit loxP-Stellen manipuliert wurden, eine effiziente Methode ist, um das tumorigene Potenzial definierter genetischer Veränderungen schnell zu testen.
Introduction
Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart bei Männern und betrifft jährlich mehr als 80.000 Menschen in den Vereinigten Staaten1. Die platinbasierte Chemotherapie ist seit mehr als drei Jahrzehnten der Standard für Patienten mit fortgeschrittenem Blasenkrebs. Die Landschaft der Blasenkrebsbehandlung wurde durch die jüngste Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) für Immuntherapie (Anti-PD-1- und Anti-PD-L1-Immun-Checkpoint-Inhibitoren), Erdafitinib (ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) und Enfortumab-Vedotin (ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat) revolutioniert2,3,4. Es stehen jedoch keine klinisch zugelassenen Biomarker zur Verfügung, um das Ansprechen auf eine Chemotherapie oder Immuntherapie vorherzusagen. Es besteht ein dringender Bedarf, informative präklinische Modelle zu erstellen, die das Verständnis der Mechanismen verbessern können, die das Fortschreiten von Blasenkrebs vorantreiben, und prädiktive Biomarker für verschiedene Behandlungsmodalitäten entwickeln können.
Ein großes Hindernis in der blasentranslationalen Forschung ist das Fehlen präklinischer Modelle, die die Pathogenese und das Behandlungsansprechen von menschlichem Blasenkrebs rekapitulieren 5,6. Es wurden mehrere präklinische Modelle entwickelt, darunter In-vitro-2D-Modelle (Zelllinien oder bedingt umprogrammierte Zellen), In-vitro-3D-Modelle (Organoide, 3D-Druck) und In-vivo-Modelle (Xenotransplantat, karzinogeninduzierte, gentechnisch veränderte Modelle und von Patienten abgeleitete Xenotransplantate)2,6. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind für viele Anwendungen in der Blasenkrebsbiologie nützlich, einschließlich Analysen von Tumorphänotypen, mechanistischen Untersuchungen von Kandidatengenen und/oder Signalwegen und der präklinischen Bewertung therapeutischer Reaktionen 6,7. GEMMs können standortspezifische Rekombinasen (Cre-loxP) verwenden, um genetische Deletionen in einem oder mehreren Tumorsuppressorgenen zu kontrollieren. Der Prozess der Erzeugung gewünschter GEMMs mit mehreren Gendeletionen ist zeitaufwendig, mühsam und teuer5. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung einer schnellen und effizienten Methode der Ex-vivo-Cre-Abgabe zur Etablierung von Blasen-Triple-Knockout-Modellen (TKO) aus normalen Maus-Urothelzellen, die dreifach floxierte Allele (Trp53, Pten und Rb1) tragen8. Der große Vorteil der Ex-vivo-Methode ist der schnelle Workflow (1-2 Wochen statt jahrelanger Mauszucht). Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Ernte normaler Urothelzellen mit floxierten Allelen, ex vivo Adenovirus-Transduktion, Organoidkulturen und in vitro und in vivo Charakterisierung bei immunkompetenten C57 BL/6J Mäusen. Diese Methode kann weiter verwendet werden, um klinisch relevante Blasenkrebs-Organoide in immunkompetenten Mäusen zu erzeugen, die eine beliebige Kombination von floxierten Allelen beherbergen.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMMs waren die Goldstandards für die Krebsmodellierung, die von normalen Zellen initiiert wurde, so dass die Folgen potenzieller onkogener Störungen (Onkogenaktivierung und / oder Verlust von Tumorsuppressoren) rigoros getestet werden konnten. Hier wird ein schnelles und effizientes Protokoll bereitgestellt, um Blasenkrebs-Organoide durch Ex-vivo-Gen-Editing von normalen Maus-Urothelzellen, die floxierte Allele in interessanten Genen tragen, zu erzeugen. H&E- und IHC-Färbungen zeigen, dass TKO-Organoide eine…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschungsarbeit wurde zum Teil von NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 und R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), der Roswell Park Alliance Foundation und der Friends of Urology Foundation unterstützt. Wir danken Marisa Blask und Mila Pakhomova für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Referencias
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