Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón
Summary
Este protocolo describe el proceso de generación y caracterización de organoides uroteliales de ratón que albergan deleciones en genes de interés. Los métodos incluyen la recolección de células uroteliales de ratón, la transducción ex vivo con adenovirus que impulsa la expresión de Cre con un promotor de CMV y la caracterización in vitro e in vivo.
Abstract
El cáncer de vejiga es un área poco estudiada, particularmente en modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM). Los GEMM endogámicos con sitios Cre y loxP específicos de tejidos han sido los estándares de oro para la orientación génica condicional o inducible. Para proporcionar modelos experimentales más rápidos y eficientes, se desarrolla un sistema de cultivo de organoides ex vivo utilizando adenovirus Cre y células uroteliales normales que transportan múltiples alelos loxP de los supresores tumorales Trp53, Pten y Rb1. Las células uroteliales normales se disocian enzimáticamente de cuatro vejigas de ratones triple floxed (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). Las células uroteliales se transducen ex vivo con adenovirus-Cre impulsado por un promotor del CMV (Ad5CMVCre). Los organoides vesicales transducidos se cultivan, propagan y caracterizan in vitro e in vivo. La PCR se utiliza para confirmar las deleciones de genes en Trp53, Pten y Rb1. La tinción de inmunofluorescencia (IF) de organoides demuestra una expresión positiva de los marcadores de linaje urotelial (CK5 y p63). Los organoides se inyectan por vía subcutánea en ratones huésped para la expansión del tumor y los pasajes en serie. La inmunohistoquímica (IHC) de los xenoinjertos exhibe expresión positiva de CK7, CK5 y p63 y expresión negativa de CK8 y Uroplakin 3. En resumen, la deleción de genes mediada por adenovirus de células uroteliales de ratón diseñadas con sitios loxP es un método eficiente para probar rápidamente el potencial tumorígeno de alteraciones genéticas definidas.
Introduction
El cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en los hombres y afecta a más de 80,000 personas anualmente en los Estados Unidos1. La quimioterapia basada en platino ha sido el estándar de atención para los pacientes con cáncer de vejiga avanzado durante más de tres décadas. El panorama del tratamiento del cáncer de vejiga ha sido revolucionado por la reciente aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de inmunoterapia (inhibidores del punto de control inmunitario anti-PD-1 y anti-PD-L1), erdafitinib (un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) y enfortumab vedotin (un conjugado anticuerpo-fármaco)2,3,4. Sin embargo, no hay biomarcadores clínicamente aprobados disponibles para predecir las respuestas a la quimioterapia o la inmunoterapia. Existe una necesidad crítica de generar modelos preclínicos informativos que puedan mejorar la comprensión de los mecanismos que impulsan la progresión del cáncer de vejiga y desarrollar biomarcadores predictivos para diferentes modalidades de tratamiento.
Un obstáculo importante en la investigación traslacional de la vejiga es la falta de modelos preclínicos que recapitulen la patogénesis del cáncer de vejiga humana y las respuestas al tratamiento 5,6. Se han desarrollado múltiples modelos preclínicos, incluyendo modelos 2D in vitro (líneas celulares o células reprogramadas condicionalmente), modelos 3D in vitro (organoides, impresión 3D) y modelos in vivo (xenoinjerto, inducido por carcinógenos, modelos genéticamente modificados y xenoinjerto derivado del paciente)2,6. Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) son útiles para muchas aplicaciones en la biología del cáncer de vejiga, incluidos los análisis de fenotipos tumorales, las investigaciones mecanicistas de genes candidatos y / o vías de señalización, y la evaluación preclínica de respuestas terapéuticas 6,7. Los GEMM pueden utilizar recombinasas específicas del sitio (Cre-loxP) para controlar las deleciones genéticas en uno o más genes supresores de tumores. El proceso de generar GEMM deseados con múltiples deleciones de genes lleva mucho tiempo, es laborioso y costoso5. El objetivo general de este método es desarrollar un método rápido y eficiente de administración de Cre ex vivo para establecer modelos de triple knockout (TKO) de vejiga a partir de células uroteliales normales de ratón portadoras de alelos triples floxed (Trp53, Pten y Rb1)8. La principal ventaja del método ex vivo es el flujo de trabajo rápido (1-2 semanas en lugar de años de cría de ratones). Este artículo describe el protocolo para la recolección de células uroteliales normales con alelos floxados, transducción de adenovirus ex vivo, cultivos de organoides y caracterización in vitro e in vivo en ratones inmunocompetentes C57 BL/6J. Este método se puede utilizar además para generar organoides de cáncer de vejiga clínicamente relevantes en ratones inmunocompetentes que albergan cualquier combinación de alelos floxed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los GEMM han sido los estándares de oro para el modelado del cáncer iniciado a partir de células normales, lo que permite probar rigurosamente las consecuencias de posibles perturbaciones oncogénicas (activación del oncogén y / o pérdida de supresores de tumores). Aquí, se proporciona un protocolo rápido y eficiente para generar organoides de cáncer de vejiga a través de la edición de genes ex vivo de células uroteliales normales de ratón que transportan alelos floxados en genes de interés. La tin…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo de investigación fue apoyado en parte por NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 y R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation y Friends of Urology Foundation. Agradecemos a Marisa Blask y Mila Pakhomova por revisar el manuscrito.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Referencias
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