אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר
Summary
פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייצור והאפיון של אורגנואידים אורותליאליים של עכברים, תוך מחיקות בגנים בעלי עניין. השיטות כוללות קצירת תאי אורותל של עכבר, התמרת ex vivo עם אדנו-וירוס המניע את ביטוי Cre עם מקדם CMV, ואפיון in vitro כמו גם in vivo .
Abstract
סרטן שלפוחית השתן הוא תחום לא מבוקר, במיוחד במודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs). GEMMs גזעיים עם אתרי Cre ו-loxP ספציפיים לרקמות היו תקני הזהב למיקוד גנים מותנה או בלתי ניתן להשראה. כדי לספק מודלים ניסיוניים מהירים ויעילים יותר, מפותחת מערכת תרבית אורגנואידית ex vivo באמצעות אדנו-וירוס Cre ותאי אורותל רגילים הנושאים אללים מרובים של loxP של מדכאי הגידול Trp53, Pten ו – Rb1. תאי אורותל רגילים מנותקים באופן אנזימטי מארבע שלפוחיות של עכברים משולשים (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). תאי האורותל מומרים ex vivo עם אדנו-וירוס-Cre המונע על ידי מקדם CMV (Ad5CMVCre). האורגנואידים המתומרים של שלפוחית השתן מתורבתים, מופצים ומאופיינים במבחנה וב-in vivo. PCR משמש לאישור מחיקות גנים ב- Trp53, Pten ו- Rb1. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של אורגנואידים מדגימה ביטוי חיובי של סמני שושלת אורותל (CK5 ועמ’ 63). האורגנואידים מוזרקים באופן תת עורי לעכברים מארחים לצורך הרחבת הגידול ומעברים סדרתיים. האימונוהיסטוכימיה (IHC) של קסנוגרפטים מציגה ביטוי חיובי של CK7, CK5 ועמ’ 63 וביטוי שלילי של CK8 ואורופלקין 3. לסיכום, מחיקת גנים בתיווך אדנו-וירוס מתאי אורותל של עכברים המהונדסים עם אתרי loxP היא שיטה יעילה לבחון במהירות את הפוטנציאל הגידולי של שינויים גנטיים מוגדרים.
Introduction
סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן הרביעי בשכיחותו בקרב גברים ומשפיע על יותר מ -80,000 אנשים מדי שנה בארצות הברית1. כימותרפיה מבוססת פלטינום היא הטיפול הסטנדרטי בחולים עם סרטן שלפוחית שתן מתקדם במשך יותר משלושה עשורים. הנוף של הטיפול בסרטן שלפוחית השתן עבר מהפכה על ידי אישור מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) לאחרונה לאימונותרפיה (מעכבי מחסום חיסוני נגד PD-1 ואנטי PD-L1), ארדפיטניב (מעכב קולטן גורם גדילה פיברובלסט) ואנפורטומאב ודוטין (מצומד נוגדן-תרופה)2,3,4. עם זאת, אין סמנים ביולוגיים מאושרים קלינית זמינים לניבוי התגובות לכימותרפיה או אימונותרפיה. יש צורך קריטי ליצור מודלים פרה-קליניים אינפורמטיביים שיכולים לשפר את ההבנה של המנגנונים המניעים את התקדמות סרטן שלפוחית השתן ולפתח סמנים ביולוגיים חזויים עבור שיטות טיפול שונות.
מכשול מרכזי במחקר התרגומי של שלפוחית השתן הוא היעדר מודלים פרה-קליניים המשחזרים את הפתוגנזה של סרטן שלפוחית השתן האנושית ואת תגובות הטיפול 5,6. פותחו מספר מודלים פרה-קליניים, כולל מודלים דו-ממדיים במבחנה (קווי תאים או תאים שתוכנתו מחדש באופן מותנה), מודלים תלת-ממדיים במבחנה (אורגנואידים, הדפסה תלת-ממדית) ומודלים in vivo (קסנוגרפט, מודלים המושרים על-ידי מסרטן, מודלים מהונדסים גנטית וקסנוגרפט שמקורו בחולה)2,6. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) שימושיים ליישומים רבים בביולוגיה של סרטן שלפוחית השתן, כולל ניתוחים של פנוטיפים של גידולים, חקירות מכניסטיות של גנים מועמדים ו/או מסלולי איתות, והערכה פרה-קלינית של תגובות טיפוליות 6,7. GEMMs יכולים להשתמש ברקומבינאזות ספציפיות לאתר (Cre-loxP) כדי לשלוט במחיקות גנטיות בגן מדכא גידול אחד או יותר. התהליך של יצירת GEMMs רצויים עם מחיקות גנים מרובות הוא גוזל זמן רב, מייגע ויקר5. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לפתח שיטה מהירה ויעילה של העברת ex vivo Cre לביסוס מודלים של נוקאאוט משולש בשלפוחית השתן (TKO) מתאי אורותל עכברים רגילים הנושאים אללים משולשים (Trp53, Pten ו- Rb1)8. היתרון העיקרי של שיטת ex vivo הוא זרימת העבודה המהירה (1-2 שבועות במקום שנים של גידול עכברים). מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לקצירת תאי אורותל רגילים עם אללים פלוקסים, התמרת אדנו-וירוס ex vivo, תרביות אורגנואידיות ואפיון in vitro ו-in vivo בעכברי C57 BL/6J אימונו-תחרותיים. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי ליצור אורגנואידים רלוונטיים מבחינה קלינית לסרטן שלפוחית השתן בעכברים מדוכאי חיסון עם כל שילוב של אללים פלוקסים.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMMs היו תקני הזהב למודלים סרטניים שיזמו מתאים רגילים, ואפשרו לבחון בקפדנות את ההשלכות של הפרעות אונקוגניות פוטנציאליות (הפעלת אונקוגן ו/או אובדן מדכאי גידולים). כאן, פרוטוקול מהיר ויעיל מסופק ליצירת אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן באמצעות עריכת גנים ex vivo של תאי אורותל עכברים רגילים ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודת מחקר זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ו- R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (מענק תמיכת ליבה של מרכז הסרטן NCI), קרן הברית של רוזוול פארק וקרן הידידים של אורולוגיה. אנו מודים למריסה בלאסק ולמילה פאחומובה על ההגהה של כתב היד.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Investigación sobre el cáncer. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
