Misurazione in vivo risolta nel tempo della dinamica dei neuropeptidi mediante immunosonda capacitiva nel cuore suino
Summary
I metodi immunochimici stabiliti per misurare i trasmettitori peptidici in vivo si basano sulla microdialisi o sul prelievo di liquidi sfusi per ottenere il campione per l’analisi offline. Tuttavia, questi soffrono di limitazioni spazio-temporali. Il presente protocollo descrive la fabbricazione e l’applicazione di un biosensore immunoprobo capacitivo che supera i limiti delle tecniche esistenti.
Abstract
La capacità di misurare in vivo biomarcatori rilevanti per la valutazione della progressione della malattia è di grande interesse per la comunità scientifica e medica. La risoluzione dei risultati ottenuti dagli attuali metodi di misurazione di alcuni biomarcatori può richiedere diversi giorni o settimane per essere ottenuta, in quanto possono essere limitati nella risoluzione sia spazialmente che temporalmente (ad esempio, microdialisi del compartimento fluido del liquido interstiziale analizzato mediante saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA], cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC] o spettrometria di massa); pertanto, la loro guida di diagnosi e trattamento tempestivi viene interrotta. Nel presente studio, viene riportata una tecnica unica per rilevare e misurare i trasmettitori peptidici in vivo attraverso l’uso di un biosensore immunoprobo capacitivo (sonda CI). Vengono descritti il protocollo di fabbricazione e la caratterizzazione in vitro di queste sonde. Vengono fornite misurazioni del rilascio in vivo di neuropeptide Y (NPY) evocato dalla stimolazione simpatica. Il rilascio di NPY è correlato al rilascio simpatico di noradrenalina per riferimento. I dati dimostrano un approccio per la misurazione rapida e localizzata dei neuropeptidi in vivo. Le applicazioni future includono la valutazione intraoperatoria in tempo reale della progressione della malattia e l’implementazione minimamente invasiva basata su catetere di queste sonde.
Introduction
Diversi metodi chimici per rilevare e quantificare i biomarcatori sono abitualmente utilizzati sia nella chimica delle proteine che nella diagnostica clinica, in particolare nelle diagnosi di cancro e nella valutazione della progressione delle malattie cardiovascolari. Attualmente, metodi come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA) e la spettrometria di massa si basano sulla raccolta di campioni dal compartimento vascolare 1,2,3 mediante prelievo di liquidi sfusi o dal compartimento interstiziale mediante microdialisi. La microdialisi impiega un tubo di membrana semipermeabile di lunghezza nota che viene collocato in una regione di interesse. Il fluido di raccolta viene perfuso attraverso la provetta per diversi minuti4 per raccogliere il campione per l’analisi5, limitando così la risoluzione temporale. In questo modo, i campioni raccolti forniscono solo un valore medio nel tempo del microambiente locale e sono limitati dalla velocità di perfusione e dalla raccolta di un volume di campione sufficiente. Inoltre, questi metodi richiedono la messa in comune di dati sperimentali e la media dei segnali; pertanto, potrebbero non riuscire a tenere conto della variabilità tra i soggetti. È importante sottolineare che il tempo tra la raccolta del campione e la successiva analisi offline preclude l’intervento clinico immediato e le terapie.
Nel presente protocollo, viene delineato l’uso di un biosensore immunoprobo capacitivo (sonda CI) per il rilevamento elettrico risolto nel tempo di specifici peptidi bioattivi. Il neuropeptide Y (NPY), rilasciato dai neuroni simpatici post-gangliari che innervano la vascolarizzazione, l’endocardio, i cardiomiociti e i gangli intracardiaci, è un importante trasmettitore peptidico neuromodulatore nel sistema cardiovascolare 6,7,8,9. Il metodo qui presentato è progettato per misurare l’NPY e la fattibilità sperimentale è dimostrata in un modello di cuore suino. Tuttavia, questo approccio si applica a qualsiasi peptide bioattivo per il quale è disponibile un anticorpo selettivo10. Questo metodo si basa sulla giunzione capacitiva tra una sonda a filo di platino e il fluido conduttivo sulla punta funzionalizzata11,12. In questa applicazione, l’interazione è stata mediata attraverso un anticorpo contro il neuropeptide bersaglio (NPY), che era legato alla punta dell’elettrodo, interfacciandosi con l’ambiente del fluido conduttivo. Questa funzionalizzazione è stata ottenuta attraverso l’elettrodeposizione di polidopamina reattiva sulla punta della sonda a filo di platino10,13.
Quando la sonda funzionalizzata con anticorpi viene posizionata in una regione di interesse in vivo, il rilascio di NPY endogeno evocato porta al legame con gli anticorpi di intrappolamento sulla punta della sonda e il fluido conduttivo sulla superficie dell’elettrodo viene spostato dalla proteina NPY. L’alterazione locale nell’ambiente elettrico provoca lo spostamento di fluido ad alta mobilità e ad alto dielettrico con una molecola immobile e caricata staticamente. Ciò altera l’interfaccia elettrodo-fluido e, quindi, la sua capacità, che viene misurata come un cambiamento nella corrente di carica in risposta a un potenziale di comando della funzione step.. Un potenziale di “reset” negativo viene impiegato immediatamente dopo ogni singolo ciclo di misurazione per respingere l’NPY legato dall’anticorpo attraverso l’interazione elettrostatica, eliminando così i siti di legame anticorpale per i successivi cicli di misurazione10. Ciò consente efficacemente la misurazione di NPY in modo risolto nel tempo. L’esclusiva tecnica CI supera i limiti dei metodi immunochimici basati sulla microdialisi sopra descritti per misurare i livelli di biomarcatori dinamici da un singolo esperimento senza pool di dati o media del segnale su diversi esperimenti9, fornendo dati in tempo quasi reale. Inoltre, la capacità di adattare questo metodo a qualsiasi biomarcatore di interesse per il quale esista un anticorpo appropriato su una scala risolta nel tempo e localizzata fornisce un importante progresso tecnico nella misurazione immunochimica per la valutazione della progressione della malattia e la guida di interventi terapeutici.
Il software per l’acquisizione e l’analisi dei dati è stato scritto su misura in IGOR Pro (un ambiente software completamente interattivo). Un sistema di convertitore analogico-digitale (A/D) emetteva una tensione di comando sotto il controllo del computer e acquisiva i dati da un amplificatore personalizzato. L’amplificatore possedeva alcune caratteristiche uniche. Questi includevano un resistore di feedback (commutabile) per ciascuno dei quattro canali di acquisizione, consentendo di scegliere circuiti di tensione di tensione di feedback da 1 MOhm o 10 MOhm per integrare la variabilità dell’elettrodo. È stata inoltre costruita un’unità di stadio con una singola testa e un circuito di terra/riferimento reciproco per tutti e quattro i canali di acquisizione per posizionare il dispositivo vicino al torace in un unico modulo fisico. Per raccogliere tutti i dati riportati è stata utilizzata un’impostazione del resistore di feedback da 1 MOhm.
Le impostazioni del filtro e del guadagno sono state telegrafate dall’amplificatore e registrate all’interno del file di dati. I dati sono stati filtrati a 1 kHz tramite un filtro Bessel analogico a 2 poli digitalizzato a 10 kHz. La differenza di potenziale tra la sonda e la soluzione conduttiva circostante crea uno strato capacitivo di Helmholtz sulla punta della sonda. Il legame del ligando all’anticorpo sulla punta della sonda provoca una carica locale alterata e, quindi, un cambiamento nella capacità di Helmholtz. Questo cambiamento nella componente capacitiva del circuito si traduce in uno spostamento dell’entità della carica iniettata necessaria per portare la sonda al potenziale nel protocollo di tensione step-function. Pertanto, il legame di un ligando specifico alla sonda funzionalizzata provoca un’alterazione nella misurazione della capacità dell’elettrodo come variazione della corrente capacitiva di picco.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive la produzione e la sperimentazione di un’immunosonda capacitiva (sonda CI) in grado di rilevare e misurare biomarcatori di interesse sia in vitro che in vivo . Il rilevamento si ottiene intrappolando il biomarcatore sulla punta dell’elettrodo. L’evento di intrappolamento altera la giunzione capacitiva tra un’immunosonda capacitiva a filo di platino e l’ambiente fluido conduttivo circostante, misurato come un cambiamento nella corrente di carica in risposta a un potenziale…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) per il supporto di esperti per gli esperimenti in vivo . Questo lavoro è stato supportato da NIH U01 EB025138 (JLA, CS).
Materials
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
Referencias
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