Измерение динамики нейропептидов in vivo с временным разрешением с помощью емкостного иммунозонда в сердце свиней
Summary
Установленные иммунохимические методы измерения пептидных передатчиков in vivo полагаются на микродиализ или объемное извлечение жидкости для получения образца для автономного анализа. Тем не менее, они страдают от пространственно-временных ограничений. Настоящий протокол описывает изготовление и применение емкостного иммунозондового биосенсора, который преодолевает ограничения существующих методов.
Abstract
Возможность измерения биомаркеров in vivo, имеющих отношение к оценке прогрессирования заболевания, представляет большой интерес для научного и медицинского сообществ. Разрешение результатов, полученных в результате современных методов измерения определенных биомаркеров, может занять несколько дней или недель для получения, поскольку они могут быть ограничены в разрешении как пространственно, так и временно (например, микродиализ жидкостного компартмента интерстициальной жидкости, анализируемой с помощью иммуноферментного анализа [ИФА], высокоэффективной жидкостной хроматографии [ВЭЖХ] или масс-спектрометрии); таким образом, нарушается их руководство своевременной диагностикой и лечением. В настоящем исследовании сообщается об уникальном методе обнаружения и измерения пептидных передатчиков in vivo с использованием емкостного биосенсора иммунозонда (CI probe). Описан протокол изготовления и характеристика in vitro этих зондов. Приведены измерения высвобождения in vivo вызванного симпатической стимуляцией нейропептида Y (NPY). Высвобождение NPY коррелирует с симпатическим высвобождением норадреналина для справки. Данные демонстрируют подход к быстрому и локализованному измерению нейропептидов in vivo. Будущие приложения включают интраоперационную оценку прогрессирования заболевания в режиме реального времени и минимально инвазивное развертывание этих зондов на основе катетера.
Introduction
Несколько химических методов обнаружения и количественной оценки биомаркеров обычно используются как в химии белка, так и в клинической диагностике, особенно в диагностике рака и оценке прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящее время такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуноферментный анализ (ИФА) и масс-спектрометрия, основаны на сборе проб из сосудистого компартмента 1,2,3 путем объемного забора жидкости или интерстициального компартмента путем микродиализа. Микродиализ использует полупроницаемую мембранную трубку известной длины, которая помещается в интересующую область. Всасывающая жидкость перфузируется через пробирку в течение нескольких минут4 для сбора образца для анализа5, тем самым ограничивая временное разрешение. Таким образом, собранные образцы обеспечивают только усредненную стоимость с течением времени местной микроокружения и ограничены скоростью перфузии и сбором достаточного объема образца. Кроме того, эти методы требуют объединения экспериментальных данных и усреднения сигналов; поэтому они могут не учитывать изменчивость между субъектами. Важно отметить, что время между сбором проб и последующим автономным анализом исключает немедленное клиническое вмешательство и терапию.
В настоящем протоколе описано использование емкостного иммунозондового биосенсора (CI-зонда) для электрического обнаружения специфических биоактивных пептидов с временным разрешением. Нейропептид Y (NPY), высвобождаемый из постганглионарных симпатических нейронов, которые иннервируют сосудистую систему, эндокард, кардиомиоциты и внутрисердечные ганглии, является основным нейромодулирующим пептидным передатчиком в сердечно-сосудистой системе 6,7,8,9. Метод, представленный здесь, предназначен для измерения NPY, а экспериментальная осуществимость демонстрируется в модели сердца свиней. Однако этот подход применим к любому биологически активному пептиду, для которого доступно селективное антитело10. Этот способ основан на емкостном соединении между зондом из платиновой проволоки и проводящей жидкостью на функционализированном наконечнике11,12. В этом приложении взаимодействие опосредовано через антитело против целевого нейропептида (NPY), который был связан с наконечником электрода, взаимодействуя со средой проводящей жидкости. Эта функционализация была достигнута путем электроосаждения реакционноспособного полидофамина на наконечник зонда10,13 из платиновой проволоки.
Когда функционализированный антителами зонд помещается в интересующую область in vivo, вызванное эндогенное высвобождение NPY приводит к связыванию с улавливающими антителами на кончике зонда, и проводящая жидкость на поверхности электрода смещается белком NPY. Локальное изменение в электрической среде приводит к вытеснению высокомобильной, высокодиэлектрической жидкости неподвижной, статически заряженной молекулой. Это изменяет интерфейс электрод-жидкость и, таким образом, его емкость, которая измеряется как изменение тока заряда в ответ на командный потенциал ступенчатой функции. Отрицательный потенциал «сброса» используется сразу после каждого отдельного цикла измерения для отталкивания связанного NPY от антитела посредством электростатического взаимодействия, тем самым очищая сайты связывания антител для последующих раундов измерения10. Это позволяет эффективно измерять NPY с временным разрешением. Уникальный метод CI преодолевает ограничения иммунохимических методов на основе микродиализа, описанных выше, для измерения динамических уровней биомаркеров из одного эксперимента без объединения данных или усреднения сигналов в течение нескольких экспериментов9, предоставляя данные почти в режиме реального времени. Более того, способность адаптировать этот метод к любому биомаркеру, представляющему интерес, для которого существует соответствующее антитело в масштабе с временным разрешением и локализацией, обеспечивает значительный технический прогресс в иммунохимическом измерении для оценки прогрессирования заболевания и руководства терапевтическими вмешательствами.
Программное обеспечение для сбора и анализа данных было написано на заказ в IGOR Pro (полностью интерактивная программная среда). Система аналого-цифрового преобразователя (A/D) выдавала командное напряжение под управлением компьютера и получала данные от пользовательского усилителя. Усилитель обладал определенными уникальными особенностями. Они включали резистор обратной связи (переключаемый) для каждого из четырех каналов сбора, что позволяло выбирать цепи зажима напряжения обратной связи 1 МОм или 10 МОм для интеграции вариативности электрода. Блок ступени с одной головкой и взаимной схемой заземления/отсчета для всех четырех каналов сбора также был построен для размещения устройства рядом с сундуком в одном физическом модуле. Для сбора всех сообщаемых данных использовалась настройка резистора обратной связи 1 МОм.
Настройки фильтра и усиления передавались по телеграфу с усилителя и записывались в файл данных. Данные фильтровались на частоте 1 кГц с помощью 2-полюсного аналогового фильтра Бесселя, оцифрованного на частоте 10 кГц. Разница в потенциале между зондом и окружающим проводящим раствором создает емкостный слой Гельмгольца на кончике зонда. Связывание лиганда с антителом на кончике зонда приводит к изменению местного заряда и, таким образом, изменению емкости Гельмгольца. Это изменение емкостной составляющей цепи приводит к сдвигу величины впрыскиваемого заряда, необходимого для приведения зонда к потенциалу в протоколе напряжения ступенчатой функции. Таким образом, связывание конкретного лиганда с функционализированным зондом приводит к изменению измерения емкости электрода как изменение пикового емкостного тока.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол описывает изготовление и тестирование емкостного иммунозонда (зонда CI), способного обнаруживать и измерять биомаркеры, представляющие интерес как в условиях in vitro , так и in vivo . Обнаружение достигается путем улавливания биомаркера на кончике электрода. Собы…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Олу Аджиджолу (Центр сердечной аритмии UCLA) за экспертную поддержку экспериментов in vivo . Эта работа была поддержана NIH U01 EB025138 (JLA, CS).
Materials
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
Referencias
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S. Adrenal responses to stress. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).
- Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction. European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).
- Farrell, D. M., et al. Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).
- Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation. JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).
- Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone. Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y. JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).
- Rigel, D. F. Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT. American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).
- Kluge, N., et al. Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
- Prodromidis, M. I. Impedimetric immunosensors-A review. Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318 (5849), 426-430 (2007).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells. Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).
- Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).
- Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices. The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).
- Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).
- Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C). The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).
- Chan, S. A., et al. Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).
- Chow, R. H., von Rüden, L., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).
- Ren, Y., et al. Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating. BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).
