长期培养用人心肌组织的制备
Summary
我们提出了一种人心室心肌组织 离体 培养的方案。它允许对收缩力和动力学进行详细分析，以及应用前负荷和后负荷来更密切地模拟 体内 生理环境。
Abstract
心肌细胞培养已经经历了大量的发展，从二维（2D）细胞培养到iPSC衍生的类器官。2019年，展示了一种从人体心脏样本中获得的离 体 培养心肌切片的方法，同时接近心肌收缩的 体内 状态。这些样本主要来自心脏移植或左心室辅助装置放置。使用振动切片机和专门开发的培养系统，在固定线和弹簧线之间放置300μm厚的切片，允许稳定和可重复的培养数周。在栽培过程中，切片根据个体设置不断受到刺激。可以实时显示和记录收缩，并且可以很容易地应用药理学药物。可以安排和执行用户定义的刺激方案，以评估重要的收缩参数，如暂停后增强、刺激阈值、力-频率关系和不应期。此外，该系统可实现可变的前负荷和后负荷设置，以实现更生理的培养。
在这里，我们提出了一个分步指南，介绍如何使用商业仿生培养解决方案成功长期培养人类左心室心肌切片。
Introduction
在过去的十年中，心肌细胞的体外培养取得了很大的进步，从2D和三维（3D）技术到使用类器官和诱导多能干细胞分化成心肌细胞1，2，3。离体和原代细胞培养已被证明具有重要价值，特别是对于遗传研究和药物开发4，5，6。使用人体组织可提高结果的转化价值。然而，具有完整几何形状的心肌组织的长期3D培养尚未得到很好的证实。完整的几何形状是模拟体内条件的关键特征，因为适当的心脏功能，不同细胞之间的通信以及细胞 – 基质相互作用是先决条件。心肌组织培养经历了不同的发展阶段。离体心肌组织培养的成功率和稳定性最初相当低，但最近的方法已经产生了有希望的结果7，8，9，10，11。
其中，Fischer等人是第一个证明人心肌组织的活力和收缩性能可以在离体细胞培养中维持数周7的人。他们的技术基于从外植的人类心肌中切割的薄组织切片，这些切片被安装在新开发的培养室中，提供明确的生物力学条件和连续的电刺激。这种培养方法与心肌组织的体内功能非常相似，并且已被几个独立的研究小组2，12，13，14，15重现。重要的是，Fischer等人使用的腔室还使已发展的力量连续注册长达4个月，从而为完整人类心肌7的生理和药理学研究开辟了前所未有的机会。
其他研究小组独立开发了类似的技术，并应用于人，大鼠，猪和兔心肌7，10，11。Pitoulis等人随后开发了一种更生理的方法，该方法在收缩周期中再现了正常的力-长度关系，但不太适合于高通量分析16。因此，仿生培养的一般方法可以被视为动物实验的还原，精炼和替换（3R）的又一步。
然而，利用这种潜力需要标准化的程序、高含量分析和高通量水平。我们提出了一种技术，该技术将活体心肌的自动切片与 体外 维护相结合，在已经商业化的仿生培养系统中（见 材料表）。使用所提出的方法，可以从单个透壁心肌标本中生成的单个切片的数量仅受处理时间的限制。具有足够大小和质量（3 cm x 3 cm）的标本通常产生20-40个组织切片，使用自动振动切片机可以方便地切割。这些切片可以放置在属于系统的培养室中。腔室允许电刺激，其参数可以调制（即脉冲持续时间，极性，速率和电流），以及使用腔室内的弹簧线调整前负和后载荷。每个切片的收缩由附着在弹簧线上的小磁铁的运动记录下来，并显示为可解释的图形。数据可以随时记录，并使用免费提供的软件进行分析。除了恒定的基线起搏外，还可以执行预定的方案，以功能评估其不应期，刺激阈值，暂停后增强和力 – 频率关系。
这种来自个体心脏的多个心肌切片的长期仿生培养为未来人类和动物组织的 离体 研究铺平了道路，并有助于筛查心血管医学中的治疗和心脏毒性药物作用。它已经应用于各种实验方法2，12，13，15。在这里，我们对人体组织的制备进行了详细的分步描述，并为经常遇到的栽培问题提供了解决方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
过去，心血管研究在心肌细胞的培养方面取得了很大进展。然而，具有完整几何形状的心肌细胞的3D培养尚未得到很好的证实。与以前用于心肌组织 离体 培养的方案相比，我们在这里描述的方案更接近 于组织的体内 环境。此外，预载和后负荷的应用允许更仿生的环境。我们能够充分分析和理解组织的收缩数据和收缩参数的连续记录。
使用类似设置的 离体</e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究由DZHK拨款81Z0600207（JH，PS和DM）和81X2600253（公元和TS）资助。
作者要感谢克劳迪娅·法尼，吴美平和马蒂亚斯·塞米施在准备设置方面的支持，以及组织培养的定期维护。
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
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