Uzun Süreli Yetiştirme için İnsan Miyokard Dokusunun Hazırlanması
Summary
İnsan ventriküler miyokard dokusunun ex vivo ekimi için bir protokol sunuyoruz. Kasılma kuvveti ve kinetiğin ayrıntılı analizinin yanı sıra, in vivo fizyolojik ortamı daha yakından taklit etmek için ön ve son yükün uygulanmasına izin verir.
Abstract
Kardiyomiyosit yetiştiriciliği, iki boyutlu (2D) hücre yetiştiriciliğinden iPSC türevi organoidlere kadar çok sayıda gelişme göstermiştir. 2019 yılında, miyokard kasılmasının in vivo durumuna yaklaşırken, insan kalp örneklerinden elde edilen miyokard dilimlerini yetiştirmenin ex vivo bir yolu gösterilmiştir. Bu örnekler çoğunlukla kalp transplantasyonlarından veya sol ventrikül destek cihazı yerleşimlerinden kaynaklanmaktadır. Bir vibratom ve özel olarak geliştirilmiş bir yetiştirme sistemi kullanılarak, sabit ve yaylı bir tel arasına 300 μm kalınlığında dilimler yerleştirilir ve birkaç hafta boyunca istikrarlı ve tekrarlanabilir bir ekime izin verir. Yetiştirme sırasında, dilimler bireysel ayarlara göre sürekli olarak uyarılır. Kasılmalar gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve kaydedilebilir ve farmakolojik ajanlar kolayca uygulanabilir. Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerini değerlendirmek için planlanabilir ve gerçekleştirilebilir. Ayrıca, sistem daha fizyolojik bir yetiştirme için değişken bir ön ve son yük ayarı sağlar.
Burada, ticari bir biyomimetik yetiştirme çözeltisi kullanarak, insan sol ventrikül miyokard dilimlerinin başarılı bir şekilde uzun vadeli bir şekilde nasıl yetiştirileceğine dair adım adım bir kılavuz sunuyoruz.
Introduction
Son on yılda, miyokard hücrelerinin in vitro yetiştirilmesi, 2D ve üç boyutlu (3D) tekniklerden, organoidlerin kullanımına ve kardiyak miyositlere farklılaştırılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımına kadar büyük ilerlemeler kaydetmiştir 1,2,3. Ex vivo ve primer hücre yetiştiriciliğinin, özellikle genetik çalışmalar ve ilaç geliştirme için büyük bir değere sahip olduğu gösterilmiştir 4,5,6. İnsan dokularının kullanılması, sonuçların translasyonel değerini arttırır. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip miyokard dokularının uzun süreli 3D yetiştiriciliği iyi kurulmamıştır. Bozulmamış geometri, in vivo koşulları taklit etmek için önemli bir özelliktir, çünkü uygun kalp fonksiyonu, farklı hücreler arasındaki iletişim ve hücre-matris etkileşimleri ön koşuldur. Miyokard doku yetiştiriciliği, gelişimin çeşitli aşamalarından geçti. Ex vivo miyokard doku yetiştiriciliğinin başarı oranı ve stabilitesi başlangıçta oldukça düşüktü, ancak son yaklaşımlar umut verici sonuçlar verdi 7,8,9,10,11.
Bunlar arasında, Fischer ve ark., insan miyokard dokusunun yaşayabilirliğinin ve kontraktil performansının ex vivo hücre yetiştiriciliğinde7. hafta boyunca korunabileceğini gösteren ilk kişilerdi. Teknikleri, tanımlanmış biyomekanik koşullar ve sürekli elektriksel stimülasyon sağlayan yeni geliştirilen yetiştirme odalarına monte edilen ekilen insan miyokardından kesilen ince doku dilimlerine dayanıyordu. Bu yetiştirme yöntemi, miyokard dokusunun in vivo fonksiyonuna çok benzemektedir ve birkaç bağımsız araştırma grubu2,12,13,14,15 tarafından çoğaltılmıştır. Daha da önemlisi, Fischer ve ark. tarafından kullanılan odalar, gelişmiş kuvvetlerin 4 aya kadar sürekli olarak kaydedilmesini sağladı ve böylece bozulmamış insan miyokardının7 fizyolojik ve farmakolojik araştırması için benzeri görülmemiş fırsatlar yarattı.
Benzer teknikler diğer gruplar tarafından bağımsız olarak geliştirilmiş ve insan, sıçan, domuz ve tavşan miyokard 7,10,11’e uygulanmıştır. Pitoulis ve ark. daha sonra bir büzülme döngüsü sırasında normal kuvvet-uzunluk ilişkisini yeniden üreten, ancak yüksek verimli analiz için daha az uygun olan daha fizyolojik bir yöntem geliştirdiler16. Bu nedenle, biyomimetik yetiştiriciliğin genel yaklaşımı, hayvan deneylerinin azaltılması, iyileştirilmesi ve değiştirilmesi (3R) için bir sonraki adım olarak kabul edilebilir.
Bununla birlikte, bu potansiyelden yararlanmak için standartlaştırılmış prosedürler, yüksek içerik analizleri ve yüksek bir verim seviyesi gerekir. Yaşayan insan miyokardının otomatik dilimlenmesini, ticari olarak temin edilebilen biyomimetik bir yetiştirme sisteminde in vitro bakım ile birleştiren bir teknik sunuyoruz (bakınız Malzeme Tablosu). Önerilen yaklaşımla, tek bir transmural miyokard örneğinden üretilebilecek bireysel dilimlerin sayısı sadece işlem süresi ile sınırlıdır. Yeterli boyut ve kalitede (3 cm x 3 cm) bir örnek genellikle otomatik bir vibratom ile uygun şekilde kesilen 20-40 doku dilimi verir. Bu dilimler sisteme ait yetiştirme odalarına yerleştirilebilir. Odalar, parametreleri modüle edilebilen elektriksel stimülasyona (yani, darbe süresi, polarite, hız ve akım) ve ayrıca odaların içindeki yaylı teller kullanılarak ön ve son yükün ayarlanmasına izin verir. Her dilimin büzülmesi, bir yay teline bağlı küçük bir mıknatısın hareketinden kaydedilir ve yorumlanabilir bir grafik olarak görüntülenir. Veriler her zaman kaydedilebilir ve serbestçe kullanılabilen yazılımlar kullanılarak analiz edilebilir. Sabit taban çizgisi hızının yanı sıra, refrakter dönemlerini, stimülasyon eşiğini, duraklama sonrası potansiyellerini ve kuvvet-frekans ilişkilerini işlevsel olarak değerlendirmek için planlanmış protokoller gerçekleştirilebilir.
Bireysel bir kalpten çoklu miyokard dilimlerinin bu uzun süreli biyomimetik ekimi, hem insan hem de hayvan dokusunda gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açar ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkilerinin taranmasını kolaylaştırır. Çeşitli deneysel yaklaşımlara zaten uygulanmıştır 2,12,13,15. Burada, insan dokusunun hazırlanmasının ayrıntılı bir adım adım tanımını veriyoruz ve sık karşılaşılan yetiştirme sorunlarına çözümler sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçmişte, kardiyovasküler araştırmalar kardiyomiyositlerin yetiştirilmesinde büyük ilerlemeler kaydetmiştir. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip kardiyomiyositlerin 3D ekimi henüz iyi kurulmamıştır. Miyokard dokusunun ex vivo yetiştirilmesi için uygulanan önceki protokollerle karşılaştırıldığında, burada anlattığımız protokol, dokunun in vivo ortamını daha yakından andırmaktadır. Ayrıca, yükleme öncesi ve sonrası uygulama daha biyomimetik bir ortam sağla…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma DZHK hibeleri 81Z0600207 (JH, PS ve DM) ve 81X2600253 (AD ve TS) tarafından finanse edildi.
Yazarlar, Claudia Fahney, Mei-Ping Wu ve Matthias Semisch’e, kurulumların hazırlanmasındaki destekleri ve doku ekiminin düzenli olarak sürdürülmesi için teşekkür eder.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
Referencias
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -. O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
