Isolement de cellules endothéliales glomérulaires de souris immortalisées conditionnellement avec des mitochondries fluorescentes

Summary

L’article décrit la méthode d’isolement des cellules endothéliales glomérulaires immortalisées conditionnellement des reins de souris transgéniques exprimant le virus simien thermolabile 40 et les mitochondries photo-activables, PhAM^excisée. Nous décrivons la procédure d’isolement des glomérules à partir de reins entiers à l’aide de billes, d’étapes de digestion, d’ensemencement et de culture de GECs-CD31 positifs.

Abstract

Le dysfonctionnement des cellules endothéliales glomérulaires (GEC) peut initier et contribuer à la dégradation de la barrière de filtration glomérulaire. L’augmentation du stress oxydatif mitochondrial a été suggérée comme un mécanisme entraînant un dysfonctionnement GEC dans la pathogenèse de certaines maladies glomérulaires. Historiquement, l’isolement des GEC des modèles in vivo a été notoirement difficile en raison des difficultés à isoler les cultures pures des glomérules. Les GEC ont des besoins de croissance complexes in vitro et une durée de vie très limitée. Ici, nous décrivons la procédure d’isolement et de culture de GEC conditionnellement immortalisés avec des mitochondries fluorescentes, permettant le suivi des événements de fission et de fusion mitochondriales. Les GEC ont été isolés à partir des reins d’une double souris transgénique exprimant le thermolabile SV40 TAg (de l’Immortomouse), favorisant conditionnellement la prolifération et supprimant la différenciation cellulaire, et une protéine fluorescente photoconvertible (Dendra2) dans toutes les mitochondries (de la souris photo-activable mitochondria [PhAM^excisée]). La lignée cellulaire stable générée permet la différenciation cellulaire après inactivation du gène TAg immortalisant SV40 et la photo-activation d’un sous-ensemble de mitochondries provoquant un passage de la fluorescence du vert au rouge. L’utilisation de mitoDendra2-GECs permet d’imager en direct les événements de distribution, de fusion et de fission des mitochondries fluorescentes sans colorer les cellules.

Introduction

Le glomérule est essentiel pour la filtration du sang en limitant le passage des grosses molécules à travers la barrière de filtration glomérulaire ^1,2. Le glomérule contient quatre types de cellules: les cellules épithéliales pariétales, les podocytes (cellules épithéliales viscérales), les cellules endothéliales glomérulaires (GEC) et les cellules mésangiales³. L’endothélium glomérulaire est caractérisé par une structure vasculaire unique, selon la présence de fenestrae nécessaires pour de grands volumes de filtration⁴. La surface apicale de l’endothélium glomérulaire est recouverte d’une couche de glycocalyx chargée négativement et d’une couche appelée couche de surface endothéliale qui crée un espace entre l’endothélium et le sang. Cette structure assure une sélectivité de charge élevée limitant le passage des molécules chargées négativement telles que l’albumine et empêchant l’adhésion leucocytaire et plaquettaire⁵.

Les GEC sont très sensibles aux changements métaboliques, tels que l’hyperglycémie associée au milieu diabétique. En effet, le diabète entraîne une circulation accrue des substances nocives, la saturation des voies métaboliques du glucose, et une perturbation de l’équilibre redox^{cellulaire 3,6}. De plus, l’augmentation des espèces réactives de l’oxygène induit un dysfonctionnement mitochondrial, ce qui affecte la fonction endothéliale⁷.

L’objectif global du protocole actuel est d’isoler les cellules endothéliales glomérulaires immortalisées présentant des caractéristiques mitochondriales fluorescentes. En effet, la culture cellulaire des GEC primaires a un cycle prolifératif limité et une sénescence précoce⁸. De plus, la présence de mitochondries fluorescentes aide à examiner les événements de fission et de fusion en réponse à l’hyperglycémie ou à tout autre traitement. Comme méthode alternative, d’autres laboratoires ont utilisé h-TERT pour immortaliser les cellules in vitro⁹.

La méthode décrite ici permet d’isoler des cellules endothéliales glomérulaires mitoDendra2 immortalisées sous condition chez des animaux âgés de 4 à 6 semaines (Figure 1). Ce protocole détaillé décrit l’utilisation de souris transgéniques (H-2K b-tsA58) hébergeant le gène 10,11 du grand antigène tumoral du virus simien 40 (SV40 TAg) pour générer des cellules thermolabiles immortalisées sous condition. Le produit du gène TAg tsA58 est fonctionnel à la température permissive de 33 °C sous le contrôle du promoteur flanquant 5′ inductible du gène H-2K^b de la souris, qui est augmenté au-dessus des niveaux basaux lors de l’exposition à l’interféron gamma (IFNγ), maintenant ainsi le phénotype de prolifération conditionnelle¹². H-2K^b se dégrade rapidement à la température non permissive de 37 °C en l’absence d’IFNγ, supprimant la fonction immortalisant du tsA58Tag dans les cellules et permettant aux cellules de développer un phénotype 13,14,15 plus différencié. Le croisement optionnel de souris transgéniques H-2Kb-tsA58 avec des souris PhAM, qui expriment un Dendra2-vert spécifique aux mitochondries (sous-unité VIII de la cytochrome c oxydase), permet la détection en direct de mitochondries fluorescentes¹⁶. La fluorescence verte Dendra2 passe à la fluorescence rouge après exposition à un laser 405 nm¹⁶. Lorsque les mitochondries fusionnent après photo-commutation, elles forment des formes allongées qui apparaissent jaunes à cause de l’échange de matière verte et jaune ou apparaissent rouges lorsqu’elles subissent une fission ^7,17. Les mitoDendra2-GECs sont un excellent outil pour étudier les réponses cellulaires des mitochondries GEC à différents stimuli.

Protocol

Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’IACUC de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï. Nous avons utilisé trois souris mâles (souris transgéniques H-2Kb-tsA58 avec des mitochondries photo-activables [PhAM]) achetées au laboratoire Jackson et maintenues sur un régime alimentaire normal. 1. Conditions de travail et préparatifs Nettoyez l’espace de travail à l’intérieur de la hotte à flux laminaire en utilisant 70…

Representative Results

Dans cet article, un protocole détaillé pour l’isolement de cellules endothéliales glomérulaires immortalisées sous condition avec des mitochondries fluorescentes stables (mitoDendra2-GECs) est décrit (Figure 1). L’utilisation de jeunes souris âgées de 6 à 10 semaines est essentielle pour obtenir un nombre important de cellules saines. Après 3 jours de culture, les cellules commencent à croître lentement à partir des glomérules isolés, comme le montre …

Discussion

Les mitochondries sont essentielles au métabolisme cellulaire, à l’homéostasie et aux réponses au stress, et leur dysfonctionnement est lié à de nombreuses maladies, y compris les maladies rénales. Les mitochondries jouent un rôle dans la génération pathologique d’espèces réactives excessives de l’oxygène (ROS), la régulation des niveaux de calcium intracellulaire, les voies de mort cellulaire et la dynamique cytosquelettique^{21,22,23</sup…}

Materials

100 µm cell strainer	Fisher	22-363-549
1ml Insulin Syringes	BD	329424
25G butterfly	BD	367298
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
30ml syringe	BD Biooscience	309650
40 µm cell strainer	Fisher	22-363-547
40 µm nylon mesh
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Bovine serum albumin	Fisher	BP1600-100
CD31	abcam	ab7388
Collagenase type I	Corning	354236
Collagenase type II	SIGMA	C6885	125CDU/mg
Collagene type IV	SIGMA	C5533-5M
Dnase-I	Qiagen	79254
Dynabeads 450	Thermofisher Scientific	14013
endothelial cells growth medium	Lonza	cc-3156
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gemini	100-106	Heat inactivated
Fibronectin	Thermofisher	33016015
Fine forceps	F.S.T Dumont	E6511
HBSS	GIBCO	14065-056
IFNg	Cell Science	CRI001B
Immortomouse	Jackson laboratory	32619	Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	25030081
Magnetic particle concentrator	Thermofisher Scientific	12320D
mitotracker	Thermofisher Scientific	M7512
PBS 1X	Corning	46-013-CM
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
PhaM mice	Jackson laboratory	18397	B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J
Protease (10 mg/ml)	SIGMA	P6911
RPMI	GIBCO	3945
Sodium Pyruvate 100mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors – Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
synaptopodin	Santa Cruz	sc-515842
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054