형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리
Summary
이 논문은 열안정성 유인원 바이러스 40 및 광활성성 미토콘드리아를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 신장으로부터 조건부로 불멸화된 사구체 내피 세포를분리하는 방법을 설명한다. 우리는 구슬, 소화 단계, 파종 및 GECs-CD31 양성의 배양을 사용하여 전체 신장에서 사구체를 분리하는 절차를 설명합니다.
Abstract
사구체 내피 세포 (GEC) 기능 장애는 사구체 여과 장벽 파괴를 시작하고 기여할 수 있습니다. 증가된 미토콘드리아 산화 스트레스는 일부 사구체 질환의 발병기전에서 GEC 기능장애를 초래하는 메커니즘으로서 제안되었다. 역사적으로 생체 내 모델에서 GEC를 분리하는 것은 사구체에서 순수 배양을 분리하는 데 어려움이 있기 때문에 악명이 높았습니다. GEC는 시험관 내에서 복잡한 성장 요구 사항과 매우 제한된 수명을 가지고 있습니다. 여기에서는 형광 미토콘드리아로 조건부로 불멸화 된 GEC를 분리하고 배양하여 미토콘드리아 분열 및 융합 이벤트를 추적 할 수있는 절차를 설명합니다. GEC는 조건부로 증식을 촉진하고 세포 분화를 억제하는 열안정성 SV40 TAg(Immortomouse로부터)를 발현하는 이중 트랜스제닉 마우스의 신장에서 분리되었으며, 모든 미토콘드리아에서 광전환성 형광 단백질(Dendra2)을 분리했습니다(광활성화 가능한 미토콘드리아[PhAM절제] 마우스로부터). 생성된 안정한 세포주는 불멸화 SV40 TAg 유전자의 불활성화 후 세포 분화를 가능하게 하고 미토콘드리아 하위 집합의 광활성화를 일으켜 형광을 녹색에서 빨간색으로 전환합니다. mitoDendra2-GEC를 사용하면 세포를 염색하지 않고도 형광 미토콘드리아의 분포, 융합 및 핵분열 이벤트를 실시간으로 이미징할 수 있습니다.
Introduction
사구체는 사구체 여과 장벽 1,2를 통과하는 큰 분자의 통과를 제한함으로써 혈액 여과에 중요합니다. 사구체는 정수리 상피 세포, 족 세포 (내장 상피 세포), 사구체 내피 세포 (GEC) 및 간질 세포3의 네 가지 세포 유형을 포함합니다. 사구체 내피는 큰 여과 부피에 필요한 fenestrae의 존재에 따라 독특한 혈관 구조를 특징으로합니다4. 사구체 내피의 정점 표면은 음전하를 띤 글리코칼릭스 층과 내피와 혈액 사이에 공간을 만드는 내피 표면층이라고 하는 코트로 덮여 있습니다. 이 구조는 알부민과 같은 음전하를 띤 분자의 통과를 제한하고 백혈구 및 혈소판 부착을 방지하는 높은 전하 선택성을 제공합니다5.
GEC는 당뇨병 환경과 관련된 고혈당증과 같은 대사 변화에 매우 민감합니다. 실제로 당뇨병은 유해 물질의 순환 증가, 포도당 대사 경로의 포화 및 세포 산화 환원 균형 방해로 이어집니다 3,6. 또한, 활성 산소 종의 증가는 내피 기능에 영향을 미치는 미토콘드리아 기능 장애를 유도합니다7.
현재 프로토콜의 전반적인 목표는 형광 미토콘드리아 특징을 가진 불멸화 된 사구체 내피 세포를 분리하는 것입니다. 실제로, 일차 GEC의 세포 배양은 제한된 증식 주기 및 초기 노화8를 갖는다. 또한, 형광 미토콘드리아의 존재는 고혈당증 또는 다른 치료에 대한 반응으로 핵분열 및 융합 사건을 검사하는 데 도움이됩니다. 대안으로 다른 실험실에서는 h-TERT를 사용하여 시험관 내9에서 세포를 불멸화했습니다.
여기에 설명 된 방법은 4-6 주 된 동물에서 조건부로 불멸화 된 mitoDendra2 사구체 내피 세포를 분리 할 수 있습니다 (그림 1). 이 상세한 프로토콜은 유인원 바이러스 40 대형 종양 항원 (SV40 TAg) 유전자10,11을 보유하고있는 트랜스 제닉 마우스 (H-2K b-tsA58)의 사용을 설명하여 열 안정성 조건부 불멸화 세포를 생성합니다. tsA58 TAg 유전자 생성물은 마우스 H-2Kb 유전자의 유도성 5′ 플랭킹 프로모터의 제어 하에 33°C의 허용 온도에서 기능하며, 이는 인터페론 감마(IFNγ)에 노출시 기저 수준 이상으로 증가하여, 조건부 증식 표현형(12)을 유지한다. H-2Kb는 IFNγ의 부재하에 37°C의 비허용 온도에서 급속히 분해되어, 세포에서 tsA58Tag의 불멸화 기능을 제거하고, 세포가 보다 분화된 표현형13,14,15를 개발할 수 있게 한다. H-2Kb-tsA58 형질전환 마우스를 미토콘드리아 특이적(시토크롬 c 산화효소의 서브유닛 VIII) Dendra2-green을 발현하는 PhAM 마우스와 임의로 교차시켜 형광 미토콘드리아16의 실시간 검출을 가능하게 합니다. Dendra2 녹색 형광은 405nm 레이저16에 노출된 후 적색 형광으로 전환됩니다. 미토콘드리아가 광 전환 후 융합되면 녹색과 노란색 물질의 교환으로 노란색으로 나타나거나 핵분열 7,17을 겪을 때 빨간색으로 나타나는 길쭉한 모양을 형성합니다. mitoDendra2-GEC는 다양한 자극에 대한 GEC 미토콘드리아의 세포 반응을 연구하기위한 훌륭한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미토콘드리아는 세포 대사, 항상성 및 스트레스 반응에 중요하며 기능 장애는 신장 질환을 포함한 많은 질병과 관련이 있습니다. 미토콘드리아는 과도한 활성 산소 종 (ROS)의 병리학 적 생성, 세포 내 칼슘 수치의 조절, 세포 사멸 경로 및 세포 골격 역학21,22,23에 역할을합니다.
쥐 GEC의 분리는 적은 수, 크?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 쥐 내피 세포 분리에 대한 통찰력에 대해 Cijiang He 교수와 Fu Jia 박사에게 감사하고 PhAM절제 마우스와 귀중한 토론을 제공한 Mone Zaidi 교수에게 감사드립니다. 저자는 또한 마운트 시나이에있는 Icahn School of Medicine의 현미경 CORE와 우리가받은 지침에 대해 직원들에게 감사하고 싶습니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R01DK097253 및 국방부 CDMRP 보조금 E01 W81XWH2010836의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
Referencias
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