Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Summary

Hirnmetastasen sind eine Ursache für schwere Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Die meisten Hirnmetastasen-Mausmodelle werden durch systemische Metastasen kompliziert, die die Analyse der Mortalität und der therapeutischen Interventionsergebnisse verwirren. Hier wird ein Protokoll für die interne Karotisinjektion von Krebszellen vorgestellt, das konsistente intrakranielle Tumoren mit minimalen systemischen Tumoren erzeugt.

Abstract

Hirnmetastasen sind eine Ursache für schwere Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Kritische Aspekte metastasierender Erkrankungen, wie die komplexe neuronale Mikroumgebung und die Stromazellinteraktion, können mit In-vitro-Assays nicht vollständig repliziert werden. Daher sind Tiermodelle entscheidend für die Untersuchung und das Verständnis der Auswirkungen therapeutischer Interventionen. Die meisten Xenografting-Methoden für Hirntumore erzeugen jedoch keine konsistenten Hirnmetastasen in Bezug auf den Zeitrahmen und die Tumorlast. Hirnmetastasenmodelle, die durch intrakardiale Injektion von Krebszellen generiert werden, können zu einer unbeabsichtigten extrakraniellen Tumorlast führen und zu nicht-hirnmetastasierender Morbidität und Mortalität führen. Obwohl die intrakranielle Injektion von Krebszellen die extrakranielle Tumorbildung einschränken kann, hat sie mehrere Vorbehalte, wie die injizierten Zellen bilden häufig eine einzelne Tumormasse an der Injektionsstelle, eine hohe leptomeningeale Beteiligung und eine Schädigung des Hirngefäßsystems während der Nadelpenetration. Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Hirnmetastasierung, die durch Injektion der inneren Halsschlagader erzeugt wird. Diese Methode erzeugt intrakranielle Tumoren konsequent ohne Beteiligung anderer Organe, was die Beurteilung von Therapeutika für Hirnmetastasen ermöglicht.

Introduction

Hirnmetastasen sind eine weit verbreitete Malignität, die mit einer sehr schlechten Prognose einhergeht ^1,2. Der Behandlungsstandard für Patienten mit Hirnmetastasen ist multimodal und besteht aus Neurochirurgie, Ganzhirnstrahlentherapie und/oder stereotaktischer Radiochirurgie, abhängig vom allgemeinen Gesundheitszustand der Patienten, der extrakraniellen Krankheitslast und der Anzahl und Lage der Tumoren im Gehirn ^3,4. Patienten mit bis zu drei intrakraniellen Läsionen kommen für eine chirurgische Resektion oder stereotaktische Radiochirurgie in Frage, während eine Ganzhirnstrahlentherapie für Patienten mit mehreren Läsionen empfohlen wird, um das Risiko einer chirurgischen Infektion und eines Ödems zu vermeiden⁵. Die Ganzhirn-Strahlentherapie kann jedoch strahlenempfindliche Hirnstrukturen schädigen und zu einer schlechten Lebensqualität beitragen⁶.

Die systemische Therapie ist ein nicht-invasiver alternativer und logischer Ansatz zur Behandlung von Patienten mit multiplen Läsionen⁷. Es wird jedoch aufgrund der seit langem bestehenden Vorstellung, dass systemische Therapien eine schlechte Wirksamkeit haben, weniger berücksichtigt, da die passive Verabreichung von Zytostatika über den Blutkreislauf keine therapeutischen Werte im Gehirn ohne das Risiko einer unsicheren Toxizität erreichen kann⁸. Dieses Paradigma beginnt sich mit der kürzlich von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen systemischen Therapie (Tucatinib mit Trastuzumab und Capecitabin indiziert für metastasierende HER2+-Brustkrebs-Hirnmetastasen)9,10,11,12 und der Aktualisierung der Behandlungsleitlinien zu ändern, um systemische Therapieoptionen für Hirnmetastasenpatientinnen einzubeziehen^13,14.

In diesem Zusammenhang können Entwicklungen auf dem Gebiet der molekularen zielgerichteten Therapie, Immuntherapie und alternativer Wirkstoffabgabesysteme, wie z. B. eines gezielten Nano-Wirkstoffträgers, möglicherweise die Herausforderungen der Behandlung von Hirnmetastasen überwinden^15,16,17,18. Darüber hinaus werden chemische und mechanische Ansätze zur Verbesserung der Wirkstoffabgabe durch Permeabilisierung der Hirntumorschranke untersucht^19,20. Um solche Ansätze zu untersuchen und zu optimieren, ist es entscheidend, präklinische Modelle zu verwenden, die nicht nur die komplexe Physiologie der Hirnmetastasierung widerspiegeln, sondern auch eine objektive Analyse der intrakraniellen Arzneimittelreaktion ermöglichen.

Im Großen und Ganzen umfassen die aktuellen Ansätze zur Modellierung der Hirnmetastasierung in vivo die intrakardiale (linke Ventrikel), intravenöse (normalerweise Schwanzvene), intrakranielle oder intracarotis (gemeinsame Halsschlagader) Injektion von Krebszellen bei Mäusen 21,22,23,24,25,26,27 . Neben Tumortransplantationsstrategien sind gentechnisch veränderte Mausmodelle, bei denen die Tumorbildung durch die Entfernung von Tumorsuppressorgenen oder die Aktivierung von Onkogenen ausgelöst wird, für die Tumormodellierung nützlich. Es wird jedoch nur berichtet, dass nur wenige gentechnisch veränderte Mausmodelle sekundäre Tumore produzieren und noch weniger, die zuverlässig Hirnmetastasen produzieren^28,29,30.

Engraftment-Methoden wie intrakardiale (linker Ventrikel) und intravenöse (meist Schwanzvene) Injektion ahmen die systemische Verbreitung von Krebs nach. Diese Modelle erzeugen typischerweise Läsionen in mehreren Organen (z. B. Gehirn, Lunge, Leber, Nieren, Milz), abhängig vom Kapillarbett, das die meisten Tumorzellen während ihres Kreislaufdurchgangs ^einfängt31. Inkonsistente Raten der Hirntransplantation erfordern jedoch mehr Tiere, um die Stichprobengröße für die gewünschte statistische Aussagekraft zu erreichen. Die Anzahl der Tumorzellen, die sich schließlich über diese intrakardialen und intravenösen Injektionsverfahren im Gehirn etablieren, ist variabel. Daher kann die Tumorlast der Hirnmetastasierung zwischen den Tieren variieren, und der Unterschied in der Progression kann die Standardisierung des experimentellen Zeitplans und die Interpretation der Ergebnisse zu einer Herausforderung machen. Die extrakranielle Tumorlast kann zu einer Mortalität ohne Hirnmetastasen führen, wodurch diese Modelle für die Bewertung der intrakraniellen Wirksamkeit ungeeignet sind. Gehirntropische Zelllinien wurden unter Verwendung künstlicher klonaler Selektionsprozesse etabliert, um die extrakranielle Etablierung zu reduzieren, aber die Aufnahmeraten waren inkonsistent, und der klonale Selektionsprozess kann die Heterogenität reduzieren, die normalerweise in menschlichen Tumoren gefunden wird³².

Gehirnspezifische Engraftment-Methoden wie die intrakranielle und intrakarotis-Injektion ermöglichen eine konsistentere und effizientere Hirnmetastasenmodellierung. Bei der intrakraniellen Methode³³ werden typischerweise Krebszellen in die frontale Großhirnrinde injiziert, wodurch ein schnelles und reproduzierbares Tumorwachstum mit geringer systemischer Beteiligung erzeugt wird. Während das Verfahren bei niedriger Mortalität gut vertragen wird³³, besteht der Vorbehalt darin, dass es sich um einen relativ groben Ansatz handelt, der schnell einen (lokalisierten) Bolus von Zellen im Gehirn einführt und keine frühe Hirnmetastasenpathogenese modelliert. Die Nadel schädigt das Gefäßsystem des Hirngewebes, was dann eine lokalisierte Entzündung verursacht ^5,34. Erfahrungsgemäß besteht die Tendenz, dass Tumorzellen während der Entfernung der Nadel zum Reflux injizieren, was zu einer leptomeningealen Beteiligung führt. Alternativ bringt die intracarotis Methode Zellen in die gemeinsame Halsschlagader mit der Mikrovaskulatur des Gehirns als erstes Kapillarbett, das angetroffen wird, wodurch das Überleben im Kreislauf, die Extravasation und die Kolonisation modelliert^{werden 24}. In Übereinstimmung mit anderen²⁵ ergab unsere Erfahrung mit dieser Methode, dass es aufgrund der unbeabsichtigten Abgabe von Krebszellen über die äußere Halsschlagader zu Kapillarbetten in diesen Geweben zu Gesichtstumoren kommen kann (unveröffentlichte Daten). Es ist möglich, Gesichtstumoren vorzubeugen, indem zuerst die äußere Halsschlagader vor der gemeinsamen Injektion der Halsschlagader ligiert wird (Abbildung 1). Im Rest des Artikels wird diese Methode als “Injektion der inneren Halsschlagader” bezeichnet. Erfahrungsgemäß erzeugt die Injektionsmethode der inneren Halsschlagader konsequent Hirnmetastasen mit sehr wenigen systemischen Ereignissen und war erfolgreich bei der Erzeugung von Hirnmetastasenmodellen verschiedener primärer Krebsarten (z. B. Melanom-, Brust- und Lungenkrebs) (Abbildung 1). Die Nachteile sind, dass es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig, invasiv ist und eine sorgfältige Optimierung der Zellzahlen und einen Überwachungszeitplan erfordert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl die intrakraniellen als auch die internen Karotis-Injektionsmethoden Mausmodelle hervorbringen, die sich für die Bewertung der therapeutischen Auswirkungen auf den Überlebensvorteil von Hirntumoren eignen.

Dieses Protokoll beschreibt die interne Karotis-Injektionsmethode, um ein Mausmodell der Hirnmetastasierung fast ohne systemische Beteiligung zu erstellen und daher für die präklinische Bewertung der Arzneimittelverteilung und Wirksamkeit experimenteller Therapeutika geeignet zu sein.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Injektionsprotokolls für die interne Halsschlagader für Hirnmetastasen. Die Injektion der internen Halsschlagader mit einer Ligatur der äußeren Halsschlagader kann zuverlässig ein Hirnmetastasenmodell aus verschiedenen primären Krebsarten erzeugen. In diesem Protokoll werden drei Ligaturen auf die Halsschlagader gelegt (in der Abbildung als L1-L3 annotiert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Alle Studien wurden innerhalb der Richtlinien des Animal Ethics Committee der University of Queensland (UQCCR/186/19) und des Australian Code for the Care and Use of Animals for Science Purpose durchgeführt. 1. Vorbereitung von Krebszellen für die Injektion HINWEIS: In dieser Studie wurde die menschliche Brustkrebszelllinie BT-474 (BT474) verwendet. BT474 wurde in einem vollständigen Wachstumsmedium kultiviert, das RPMI 1640-Medium umfasste, ergän…

Representative Results

Vergleich der Injektion der Halsschlagader mit oder ohne Ligatur der Arteria carotis externWenn Krebszellen über die gemeinsame Halsschlagader injiziert wurden, ohne vorher die äußere Halsschlagader zu ligieren24, wurden bei 77,8% der transplantierten Mäuse Gesichtstumoren gefunden (n = 7/9 Tiere). Ein Beispiel für einen Gesichtstumor ist in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode verhindert…

Discussion

Hirnmetastasierung ist ein komplexer Prozess von Krebszellen, die sich von ihrem primären Ort zum Gehirn ausbreiten. Es stehen verschiedene Tiermodelle zur Verfügung, die bestimmte Stadien dieses mehrstufigen Prozesses widerspiegeln, und es gibt physiologische und praktische Überlegungen zur Gestaltung präklinischer Metastasenstudien^41,42. Die meisten veröffentlichten Studien, die den Einsatz von Nanomedizin zur Behandlung von Hirnmetastasen untersuchen, hab…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010