ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسان كنموذج واعد في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول لقياس الانقباض والفيزيولوجيا الكهربية ل hiPSC-CMs.
السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق. لذلك ، يعد استخدام نماذج تقييم سلامة القلب قبل السريرية المناسبة خطوة حاسمة أثناء تطوير الدواء. حاليا ، لا يزال تقييم سلامة القلب يعتمد بشكل كبير على الدراسات التي أجريت على الحيوانات. ومع ذلك ، تعاني النماذج الحيوانية من ضعف الخصوصية الانتقالية للبشر بسبب الاختلافات الخاصة بالأنواع ، خاصة من حيث الخصائص الكهروفسيولوجية القلبية. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير نموذج موثوق به وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية. ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) كنموذج لا يقدر بثمن في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. يمكن الحصول على hiPSC-CMs من الأفراد ذوي الخلفيات الوراثية المتنوعة والحالات المرضية المختلفة ، مما يجعلها بديلا مثاليا لتقييم سمية القلب الناجمة عن الأدوية بشكل فردي. لذلك ، يجب وضع منهجيات للتحقيق الشامل في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل العديد من الفحوصات الوظيفية التي يمكن تقييمها على hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم. بشكل عام ، فإن دمج hiPSC-CMs في تقييم سلامة القلب قبل السريرية لديه القدرة على إحداث ثورة في تطوير الأدوية.
تطوير الأدوية عملية طويلة ومكلفة. أفادت دراسة للعقاقير العلاجية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بين عامي 2009 و 2018 أن متوسط التكلفة المقدرة للبحوث والتجارب السريرية المرسملة كان 985 مليون دولار لكل منتج1. السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق2. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن سمية القلب بين فئات متعددة من الأدوية العلاجية3. لذلك ، يعد تقييم سلامة القلب مكونا حاسما أثناء عملية تطوير الدواء. لا يزال النموذج الحالي لتقييم سلامة القلب يعتمد اعتمادا كبيرا على النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، يتم التعرف بشكل متزايد على الاختلافات بين الأنواع من استخدام النماذج الحيوانية كسبب رئيسي للتنبؤات غير الدقيقة لسمية القلب الناجمة عن المخدرات في المرضى من البشر4. على سبيل المثال ، يختلف مورفولوجيا إمكانات عمل القلب اختلافا كبيرا بين البشر والفئران بسبب المساهمات من تيارات إعادة الاستقطاب المختلفة5. بالإضافة إلى ذلك ، تم توثيق الأشكال التفاضلية للميوسين القلبي والحمض النووي الريبي الدائري الذي يمكن أن يؤثر على فسيولوجيا القلب بشكل جيد بين الأنواع 6,7. لسد هذه الفجوات ، من الضروري إنشاء نموذج موثوق وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية.
أدى الاختراع الرائد لتكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) إلى إنشاء منصات غير مسبوقة لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض. على مدى العقد الماضي ، أصبحت طرق توليد الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسانراسخة 8,9. اجتذبت hiPSC-CMs اهتماما كبيرا بتطبيقاتها المحتملة في نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. على سبيل المثال ، تم استخدام hiPSC-CMs لنمذجة الأنماط الظاهرية المرضية لأمراض القلب الناجمة عن الوراثة الوراثية ، مثل متلازمة QT الطويلة 10 ، واعتلال عضلة القلب الضخامي11,12 ، واعتلال عضلة القلب الموسع13,14,15. ونتيجة لذلك، تم تحديد مسارات الإشارات الرئيسية المتورطة في التسبب في أمراض القلب، والتي يمكن أن تلقي الضوء على الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للعلاج الفعال. علاوة على ذلك ، تم استخدام hiPSC-CMs لفحص سمية القلب الناجمة عن الأدوية المرتبطة بالعوامل المضادة للسرطان ، بما في ذلك مثبطات دوكسوروبيسين وتراستوزوماب والتيروزين كيناز16،17،18 ؛ ويجري التحقيق في استراتيجيات للتخفيف من سمية القلب الناتجة عن ذلك. وأخيرا ، فإن المعلومات الجينية المحتفظ بها في hiPSC-CMs تسمح بفحص والتنبؤ بسمية القلب الناجمة عن المخدرات على كل من المستوى الفردي والسكاني19,20. بشكل جماعي ، أثبتت hiPSC-CMs أنها أداة لا تقدر بثمن للتنبؤ بسلامة القلب الشخصية.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو وضع منهجيات للتحقيق بشكل شامل وفعال في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، والتي لها أهمية كبيرة في تطبيق hiPSC-CMs نحو نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. هنا ، نقوم بتفصيل مجموعة من الفحوصات الوظيفية لتقييم الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم (Ca2 +) (الشكل 1).
برزت تقنية iPSC البشرية كمنصة قوية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس انقباض hiPSC-CM ، وإمكانات المجال ، وإمكانات العمل ، و Ca2 + العابر. يوفر هذا البروتوكول توصيفا شاملا لانقباض hiPSC-CM والفيزيولوجيا الكهربية. تم تطبيق هذه الفحوصات الوظيفية في منشورات متعددة من مجم?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر بليك وو على التدقيق اللغوي للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL113006 و R01 HL141371 و R01 HL163680 و R01 HL141851 و U01FD005978 و NASA NNX16A069A (JCW) و AHA PostPhD Fellowship 872244 (GMP).
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
NIS Elements AR | |||
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |