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Medicina

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

Published: August 04, 2022
doi:
10.3791/64265
, , , ,
1Stanford Cardiovascular Institute,Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine,Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology,Stanford University School of Medicine

Summary

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다. 따라서 적절한 전임상 심장 안전성 평가 모델을 사용하는 것은 약물 개발 과정에서 중요한 단계입니다. 현재 심장 안전성 평가는 여전히 동물 연구에 크게 의존하고 있습니다. 그러나 동물 모델은 종 특이적 차이, 특히 심장 전기생리학적 특성 측면에서 인간에 대한 열악한 번역 특이성에 시달리고 있습니다. 따라서, 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고, 효율적이며, 인간 기반 모델을 개발하는 것이 시급하다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 귀중한 시험 관 내 모델로 부상했습니다. hiPSC-CM은 다양한 유전적 배경과 다양한 질병 상태를 가진 개인으로부터 얻을 수 있으므로 약물 유발 심장 독성을 개별적으로 평가하는 데 이상적인 대용물입니다. 따라서 hiPSC-CM의 기능적 특성을 종합적으로 조사할 수 있는 방법론을 수립할 필요가 있다. 이 프로토콜에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM에서 평가할 수 있는 다양한 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다. 전반적으로 hiPSC-CM을 전임상 심장 안전성 평가에 통합하면 약물 개발에 혁명을 일으킬 잠재력이 있습니다.

Introduction

약물 개발은 길고 비용이 많이 드는 과정입니다. 2009년과 2018년 사이에 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 신약 치료에 대한 연구에 따르면 자본화된 연구 및 임상 시험의 예상 중간비용은 제품당 9억 8,500만 달러였습니다1. 약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다2. 특히, 심장 독성은 여러 종류의 치료 약물3에서 보고됩니다. 따라서 심장 안전성 평가는 약물 개발 과정에서 중요한 구성 요소입니다. 심장 안전성 평가를위한 현재의 패러다임은 여전히 동물 모델에 크게 의존합니다. 그러나, 동물 모델의 사용으로부터의 종 차이는 인간 환자에서 약물 유도 심장 독성에 대한 부정확 한 예측의 주요 원인으로 점점 더 인식되고있다4. 예를 들어, 심장 활동 전위의 형태는 상이한 재분극 전류5로부터의 기여로 인해 인간과 마우스 사이에 실질적으로 다르다. 또한, 심장 생리학에 영향을 줄 수있는 심장 미오신 및 원형 RNA의 차등 이소 형은 종 6,7에서 잘 문서화되었습니다. 이러한 격차를 해소하려면 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 인간 기반 모델을 구축하는 것이 필수적입니다.

유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 획기적인 발명은 전례 없는 약물 스크리닝 및 질병 모델링 플랫폼을 생성했습니다. 지난 10 년 동안 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)를 생성하는 방법은 잘 확립되었습니다 8,9. hiPSC-CM은 질병 모델링, 약물 유발 심장 독성 스크리닝 및 정밀 의학에서의 잠재적 응용 분야에 큰 관심을 끌었습니다. 예를 들어, hiPSC-CM은 긴 QT 증후군 10, 비대성 심근 병증11,12 및 확장 성 심근 병증13,14,15와 같은 유전 적 유전에 의해 유발되는 심장 질환의 병리학 적 표현형을 모델링하는 데 활용되었습니다. 결과적으로 심장 질환의 발병 기전과 관련된 주요 신호 전달 경로가 확인되어 효과적인 치료를위한 잠재적 인 치료 전략을 밝힐 수 있습니다. 또한, hiPSC-CM은 독소루비신, 트라스투주맙 및 티로신 키나제 억제제16,17,18을 포함한 항암제와 관련된 약물 유도 심장 독성을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 결과적인 심장 독성을 완화하기위한 전략이 조사 중입니다. 마지막으로, hiPSC-CM에 보유 된 유전 정보는 개인 및 인구 수준19,20 모두에서 약물 유발 심장 독성의 스크리닝 및 예측을 가능하게합니다. 종합적으로 hiPSC-CM은 개인화된 심장 안전 예측을 위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 hiPSC-CM을 질병 모델링, 약물 유발 심장 독성 스크리닝 및 정밀 의학에 적용하는 데 매우 중요한 hiPSC-CM의 기능적 특성을 포괄적이고 효율적으로 조사하는 방법론을 수립하는 것입니다. 여기에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘(Ca 2+) 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM의 기능적 특성을 평가하기 위한 일련의 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다(그림 1).

Protocol

1. 매체 및 용액 준비 50x B27 보충제 10mL 병과 RPMI 1640 배지 500mL를 혼합하여 hiPSC-CM 유지 배지를 준비합니다. 배지를 4 ° C에 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오. 사용하기 전에 매체를 실온(RT)으로 평형화하십시오. 혈청 대체 배지 20mL와 hiPSC-CM 유지 배지 180mL(10% 희석, v/v)를 혼합하여 hiPSC-CM 파종 배지를 준비합니다. 신선하게 준비된 파종 배지가 선호되지만 4 ° C에서 2 주…

Representative Results

이 프로토콜은 hiPSC-CM의 수축 운동, 전계자전위, 활동전위 및Ca 2+ 과도 상태를 측정하는 방법을 설명합니다. 효소 소화, 세포 파종, 유지 및 기능 분석 전도를 포함하는 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. hiPSC-CM 단층의 형성은 수축 운동 측정에 필요합니다(그림 2B). hiPSC-CM의 수축-이완 운동의 대표적인 흔적이 그림 2C에 나?…

Discussion

인간 iPSC 기술은 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼으로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM 수축성, 전계자전위, 활동전위 및Ca2+ 과도 상태를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 hiPSC-CM 수축성 및 전기 생리학의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이러한 기능적 분석은 우리 그룹 12,13,18,24,25,26,27의 여러 간행물에 적용되었습니다.<s…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

원고를 교정해 주신 Blake Wu에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 및 NASA NNX16A069A (JCW) 및 AHA 박사후 연구원 872244 (GMP)의 지원을 받았습니다.

Materials

35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting
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Referencias

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Keywords: Human IPSC-derived CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentPre-clinical EvaluationMicroelectrode ArrayPatch ClampDisease ModelingDrug-induced Cardiotoxicity ScreeningPrecision MedicineCell CultureExtracellular MatrixCell SeedingSpontaneous Beating
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Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).
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