합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정
Summary
상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.
Abstract
종양 세포는 운동성이 높고 침습적이며 변형된 유전자 발현 패턴을 나타냅니다. 유전자 발현의 변화가 종양 세포의 이동과 침입을 어떻게 조절하는지에 대한 지식은 종양 세포가 인접한 건강한 조직으로 침투하여 전이되는 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이전에는 유전자 녹다운(knockdown)에 이은 임피던스 기반 종양 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 통해 종양 세포 이동 및 침습에 필요한 유전자를 식별할 수 있음을 입증했습니다. 최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신은 치료 목적으로 합성 mRNA를 사용하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다. 여기서는 유전자 과발현이 종양 세포 이동 및 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 합성 mRNA를 이용한 방법을 수정하였다. 이 연구는 합성 mRNA transfection을 통한 유전자 발현 증가 후 임피던스 기반 실시간 측정이 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법 논문은 종양 세포 이동 및 침습에 대한 변경된 유전자 발현의 영향을 조사하는 절차에 대한 중요한 세부 정보를 제공합니다.
Introduction
종양 세포 운동성은 전이 1,2에 중요한 역할을 합니다. 종양 세포가 인접 및 원격 건강 조직으로 퍼지면 암 치료가 어려워지고 재발에 기여합니다 3,4. 따라서 종양 세포 운동성의 메커니즘을 이해하고 관련 치료 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 많은 종양 세포가 유전자 발현 프로파일을 변경했기 때문에 유전자 발현 프로파일의 어떤 변화가 종양 세포 운동성의 변화로 이어지는지 이해하는 것이 중요합니다 5,6.
in vitro에서 세포 이동을 측정하기 위해 여러 분석법이 개발되었습니다. 일부 분석법은 특정 시점에서만 측정이 가능하기 때문에 제한된 정보만 제공하는 반면, 다른 분석법은 종양 세포 운동성에 대한 포괄적인 정보를 실시간으로 제공한다7. 이러한 세포 운동성 분석의 대부분은 주어진 시간 또는 종말점에서 정량적 결과를 제공할 수 있지만 실험 기간 동안 세포 이동 속도의 동적 변화에 대한 충분히 자세한 정보를 제공하지 못합니다. 또한 실험 설계, 세포 유형 및 세포 수에 따라 세포 이동 속도의 잠재적 변화를 조사하기 어려울 수 있습니다. 또한, 복잡하지 않은 치료의 효과는 전통적인 운동성 분석의 간단한 정량화로 조사할 수 있지만, 다양한 복합 치료의 복잡한 효과를 연구하기 위해서는 보다 정교한 정량화가 필요할 수 있다8.
미세전극으로 덮인 마이크로타이터 플레이트 웰 바닥의 전류를 모니터링하는 기기가 개발되었다9. 우물 표면에 대한 세포의 접착은 전자 흐름을 방해하고 임피던스는 세포의 양적 및 질적 결합과 관련이 있습니다. 웰 바닥에 미세 전극이 있으면 세포 접착, 확산 및 증식을 측정할 수 있습니다. 상부 챔버의 미세 다공성 막 아래에 미세 전극이 존재하면 하부 챔버로의 세포 이동 및 침범을 측정할 수 있으며, 상부 챔버는 침범을 허용하기 위해 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅되어 있다10.
이전에는 종양 세포 이동 및 침습에 대한 임피던스 기반 실시간 측정이 전체 실험 동안 실시간 데이터를 제공할 뿐만 아니라 다양한 실험 조건 하에서 즉각적인 비교 및 정량화를 제공한다는 것이 입증되었습니다11. 이 방법 논문에서는 종양 세포 이동 및 침입에서 관심 단백질의 역할을 테스트하기 위해 유전자 녹다운을 유도했습니다. 테스트된 실험 조건에서 완전한 유전자 녹다운 효과는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용한 전기천공법 후 3-4일이 걸렸기 때문에8, 전기천공법 후 세포를 다시 도금하고 3일 후에 종양 세포 이동 및 침습의 임피던스 기반 실시간 측정을 위해 재수확했습니다.
키나아제(Crk) 및 Crk-유사(CrkL)의 CT10 조절자는 다양한 성장 인자 수용체 키나아제 경로 및 비수용체 티로신 키나아제 경로의 다운스트림에서 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 어댑터 단백질이다12. Crk 및 CrkL 단백질의 수치가 높아지면 교모세포종을 포함한 여러 인간 암의 예후가 좋지 않습니다13. 그러나 Crk 및 CrkL 단백질의 증가가 어떻게 나쁜 예후로 이어지는지는 불분명합니다. 따라서 Crk 및 CrkL 과발현이 종양 세포 기능에 미치는 영향을 정의하는 것이 중요합니다. 이전에는 Crk 및 CrkL 단백질의 내인성 수준이 교모세포종 세포 이동 및 침습에 필요하다는 것을 입증하기 위해 유전자 knockdown 연구가 수행되었습니다8. 여기에서 종양 세포 이동 및 침습에 대한 Crk 및 CrkL 과발현의 영향을 해결하기 위해 수정된 분석 시스템이 개발되었습니다.
최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신의 개발로 인해 mRNA의 체외 합성 및 치료 응용 분야가 다시 주목을 받고 있습니다(Verbeke et al.14 검토). 또한 암 및 기타 질병에서 합성 mRNA를 사용하는 데 있어 놀라운 발전이 이루어졌습니다15,16. 세포의 전기천공법은 합성 mRNA를 전달하고 일시적인 유전자 변형을 유도하는 효과적인 방법이며(Campillo-Davo et al.17에 의해 검토됨), 합성 mRNA의 사용은 불멸화된 섬유아세포에서 빠르고 효율적인 유전자 발현을 가능하게 한다 18. 이 방법 논문은 합성 mRNA를 사용한 유전자 과발현과 실시간 세포 분석을 결합하여 종양 세포 이동 및 침입을 연구합니다. 그러나, siRNA에 사용되는 실험 방식은 합성 mRNA 형질주입 시 외인성 단백질의 수준이 급격히 증가하고 점차적으로 감소하기 때문에 합성 mRNA 형질주입에는 효과가 없다18. 따라서, 세포를 추가로 배양하지 않고 형질주입 직후 세포 이동 및 침습에 대한 실시간 분석을 수행할 수 있도록 방법을 수정하였다.
이 분석법 논문은 임피던스 기반 실시간 측정과 종양 세포의 합성 mRNA의 transfection을 결합하면 종양 세포 이동 및 침습에 대한 유전자 상향 조절의 효과에 대한 빠르고 포괄적인 분석을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 분석법 논문은 교모세포종 세포의 이동 및 침습이 Crk 및 CrkL의 과발현에 의해 어떻게 영향을 받는지 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이 논문은 종양 세포 이동에 대한 합성 mRNA의 농도 의존적 효과를 조사함으로써 단백질 수준의 증가가 종양 세포 이동을 어떻게 자극하는지 명확하게 설명합니다. 또한, 종양 세포 침범에 대한 유전자 발현 변화의 영향을 평가하기 위해 ECM 겔의 농도를 변화시키는 접근법을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이동과 침입은 종양 세포의 중요한 특징입니다. 종양 세포의 운동성을 측정하고 종양 세포 운동성을 조절하는 근본적인 메커니즘을 이해하면 치료 개입에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 2,27. 세포 이동을 연구하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었다7. 스크래치 또는 배양 삽입물을 사용하는 상처 치유 분석은 간극 봉합의 대조 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 원고를 편집해 준 Children’s Mercy Kansas City의 Medical Writing Center에 감사를 표합니다. 이 작업은 Natalie’s A.R.T. Foundation(T.P.)과 Children’s Mercy Hospital(CMH) 및 University of Kansas Cancer Center(KUCC)의 MCA Partners Advisory Board 보조금(T.P.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
Referencias
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
