Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.
Vroege erytroïde voorlopers werden oorspronkelijk gedefinieerd door hun kolonievormende potentieel in vitro en ingedeeld in burst-vormende en kolonievormende “eenheden” bekend als BFU-e en CFU-e. Tot voor kort waren methoden voor de directe prospectieve en volledige isolatie van zuivere BFU-e en CFU-e voorlopers uit vers geïsoleerd volwassen muizenbeenmerg niet beschikbaar. Om deze kloof aan te pakken, werd een eencellige RNA-seq (scRNAseq) dataset van het beenmerg van muizen geanalyseerd op de expressie van genen die coderen voor celoppervlakmarkers. Deze analyse werd gecombineerd met cel lot assays, waardoor de ontwikkeling van een nieuwe flowcytometrische benadering mogelijk werd die volledige en zuivere subsets van BFU-e en CFU-e voorlopers in het beenmerg of de milt van muizen identificeert en mogelijk maakt. Deze benadering identificeert ook andere voorlopersubsets, waaronder subsets verrijkt voor basofielen / mestcellen en megakaryocytische potentialen. De methode bestaat uit het labelen van verse beenmerg- of miltcellen met antilichamen gericht op Kit en CD55. Voorlopers die beide markers uitdrukken, worden vervolgens onderverdeeld in vijf hoofdpopulaties. Populatie 1 (P1 of CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) bevat alle CFU-e voorlopers en kan verder worden onderverdeeld in respectievelijk P1-low (CD71med CD150high) en P1-hi (CD71high CD150low), overeenkomend met respectievelijk vroege en late CFU-e; Populatie 2 (P2 of BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) bevat alle BFU-e voorlopers; Populatie P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is verrijkt voor basofiele/mestcelvoorlopers; Populatie 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is verrijkt voor megakaryocytische voorlopers; en Populatie 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41–) bevat voorlopers met erytroïde, basofiele/mestcel en megakaryocytisch potentieel (EBMP) en erytroïde/ megakaryocytische/ basofiel-bevooroordeelde multipotentiële voorlopers (MPP’s). Deze nieuwe benadering maakt een grotere precisie mogelijk bij het analyseren van erytroïde en andere hematopoëtische voorlopers en maakt ook verwijzing naar transcriptoominformatie mogelijk voor elke flowcytometrisch gedefinieerde populatie.
Erytropoëse kan worden onderverdeeld in twee hoofdfasen: vroege erytropoëse en erytroïde terminale differentiatie (figuur 1)1,2,3. In vroege erytropoëse binden hematopoëtische stamcellen zich aan de erytroïde afstamming en geven ze aanleiding tot vroege erytroïde voorlopers, die voor het eerst werden geïdentificeerd in de jaren 1970 op basis van hun kolonievormend potentieel in halfvast medium 4,5,6,7,8,9 . In grote lijnen zijn erytroïde voorlopers verdeeld in twee categorieën: eerdere voorlopercellen die elk aanleiding geven tot een “burst” (een groot aggregaat van kleinere erytroïde celclusters), genaamd “burst-forming unit erythroid” of BFU-e 4,5,6; en hun nakomelingen, die elk een enkele, kleine erytroïde celcluster of kolonie vormen, genaamd “kolonievormende eenheid erytroïde” of CFU-e 7,8,9. BFU-e en CFU-e brengen nog geen terminale erytroïde genen tot expressie en zijn morfologisch niet herkenbaar. Na een aantal zelfvernieuwings- of expansieceldelingen ondergaat de CFU-e een transcriptionele schakelaar waarbij erytroïde genen zoals globines worden geïnduceerd, waardoor deze overgaat in erytroïde terminale differentiatie (ETD)1,10. Tijdens ETD ondergaan erytroblasten drie tot vijf rijpingsceldelingen voordat ze enucleeren om reticulocyten te vormen, die rijpen tot rode bloedcellen.
Erytroblasten tijdens terminale differentiatie werden oorspronkelijk geclassificeerd op basis van hun morfologie in proerytroblasten, basofiele, polychromatische en orthochromatische. De komst van flowcytometrie maakte hun prospectieve sortering en isolatie mogelijk op basis van celgrootte (gemeten door voorwaartse spreiding, FSC) en twee celoppervlakmarkers, CD71 en Ter11911,12,13 (figuur 1). Deze en soortgelijke flowcytometrische benaderingen14 hebben een revolutie teweeggebracht in het onderzoek naar de moleculaire en cellulaire aspecten van ETD, waardoor ontwikkelingsstadiumspecifieke analyse van erytroblasten in vivo es in vitro 10,15,16,17,18,19,20 mogelijk is. De CD71/Ter119-benadering wordt nu routinematig gebruikt bij de analyse van erytroïde precursoren.
Tot voor kort is een vergelijkbare, toegankelijke flowcytometrische benadering voor directe, zeer zuivere prospectieve isolatie van CFU-e en BFU-e uit muizenweefsel onderzoekers ontgaan. In plaats daarvan hebben onderzoekers flowcytometrische strategieën gebruikt die slechts een fractie van deze voorlopers isoleren, vaak in de aanwezigheid van niet-erytroïde cellen die co-zuiveren binnen dezelfde flowcytometrische subsets21. Bijgevolg was het onderzoek van BFU-e en CFU-e beperkt tot in vitro differentiatiesystemen die BFU-e en CFU-e afleiden en versterken van eerdere beenmergvoorlopers. Het is dan mogelijk om flowcytometrische strategieën toe te passen die CFU-e onderscheiden van BFU-e in deze erytroïde voorloperverrijkte culturen22,23. Een alternatieve benadering maakt gebruik van foetale CFU-e en BFU-e, die sterk verrijkt zijn in de Ter119-negatieve fractie van de foetale lever van de muis halverwege de zwangerschap 10,24,25. Geen van deze benaderingen maakt echter het onderzoek van volwassen BFU-e en CFU-e in hun fysiologische toestand in vivo mogelijk. De omvang van de uitdaging kan worden gewaardeerd wanneer eraan wordt herinnerd dat, op basis van kolonievormingstests, deze cellen aanwezig zijn in het volwassen beenmerg met een frequentie van respectievelijk slechts 0,025% en 0,3%6.
Het hier beschreven protocol is een nieuwe flowcytometrische benadering op basis van eencellige transcriptomische analyse van vers geoogste Kit+ beenmergcellen van muizen (Kit wordt uitgedrukt door alle vroege voorloperpopulaties van het beenmerg)1. Onze aanpak bevat enkele celoppervlakmarkers die al in gebruik waren door Pronk et al.21,26. Eencellige transcriptomen werden gebruikt om combinaties van celoppervlakmarkers te bepalen die erytroïde en andere vroege hematopoëtische voorlopercellen identificeren (figuur 2). In het bijzonder kan de CD55+ fractie van lineage-negatieve (Lin–) Kit+ cellen worden onderverdeeld in vijf populaties, waarvan er drie aaneengesloten segmenten van het erytroïde traject opleveren (figuur 2). De transcriptomische identiteiten van elk van deze populaties werden bevestigd door sortering, gevolgd door scRNAseq en projectie van de gesorteerde eencellige transcriptomen terug op de oorspronkelijke transcriptomische kaart (de genexpressie in elk van de vijf populaties en de volledige beenmergdataset kan worden onderzocht in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Het potentieel van het lot van elk van de populaties werd bevestigd met behulp van traditionele kolonievormingstests (figuur 2), evenals een nieuwe high-throughput single-cell fate assay 1,27. Deze analyses tonen aan dat de nieuwe flowcytometrische benadering resulteert in een zeer zuivere isolatie van alle BFU-e en CFU-e voorlopers van vers volwassen beenmerg en milt. In het bijzonder bevat populatie 1 (P1) alleen CFU-e en geen andere hematopoëtische voorlopers, en populatie 2 (P2) bevat alle BFU-e-voorlopers van het beenmerg en een klein aantal CFU-e, maar geen andere voorlopers1. Het gedetailleerde protocol hieronder wordt verder geïllustreerd met een voorbeeldexperiment bij muizen die werden geïnjecteerd met een zoutoplossing of met het erytropoësestimulerend hormoon erytropoëtine (Epo).
Het vermogen om BFU-e en CFU-e voorlopers prospectief te isoleren rechtstreeks uit vers weefsel met hoge zuiverheid was eerder onderzoekers ontgaan. Onze nieuwe aanpak, gevalideerd met scRNAseq en cell fate assays 1,27, biedt nu de tools om dit te doen.
Er zijn een aantal belangrijke punten voor het succesvol uitvoeren van zowel de sorteer- als de analytische protocollen. Eerst moeten de cellen worden gesponnen bij 900 x g om …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies R01DK130498, R01DK120639 en R01HL141402
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |