유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리
Summary
여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.
Abstract
초기 적혈구 전구 세포는 원래 시험관 내에서 콜로니 형성 잠재력에 의해 정의되었으며 BFU-e 및 CFU-e로 알려진 파열 형성 및 집락 형성 “단위”로 분류되었습니다. 최근까지, 새로 분리된 성인 마우스 골수로부터 순수한 BFU-e 및 CFU-e 전구세포를 직접 전향적이고 완전히 분리하는 방법은 이용 가능하지 않았다. 이러한 격차를 해소하기 위해 마우스 골수의 단일 세포 RNA-seq (scRNAseq) 데이터 세트를 분석하여 세포 표면 마커를 암호화하는 유전자의 발현을 분석했습니다. 이 분석은 세포 운명 분석과 결합되어 마우스 골수 또는 비장에서 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 완전하고 순수한 하위 집합을 식별하고 분리할 수 있는 새로운 유세포 분석 접근법을 개발할 수 있었습니다. 이 접근법은 또한 호염기구/비만 세포 및 거핵구 전위에 대해 풍부한 하위세트를 포함하는 다른 전구 하위세트를 식별한다. 이 방법은 신선한 골수 또는 비장 세포를 Kit 및 CD55로 향하는 항체로 표지하는 것으로 구성됩니다. 이 두 마커를 모두 발현하는 전구 세포는 5 개의 주요 집단으로 세분됩니다. 집단 1(P1 또는 CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high)은 모든 CFU-e 전구 세포를 포함하며, 각각 초기 및 후기 CFU-e에 해당하는 P1-low(CD71med CD150 high) 및 P1-hi(CD71 high CD150low)로 더 세분화될 수 있다. 인구 2 (P2 또는 BFU-e, 키트 + CD55 + CD49f med / 낮은 CD105 med / 높은 CD71 낮은 CD150높음)는 모든 BFU-e 전구 세포를 포함합니다. 집단 P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f 중간/높은 CD105 중간/낮은 CD150낮은 CD41낮음)은 호염기구/비만 세포 전구체에 대해 풍부합니다. 인구 4 (P4, Kit + CD55 + CD49f 중간 / 높은 CD105중간 / 낮은 CD150높은 CD41 +)는 거대 핵 세포 전구 세포에 대해 풍부합니다. 및 인구 5(P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41–)에는 적혈구, 호염기구/비만 세포 및 거대핵구 전위(EBMP) 및 적혈구/거핵세포/호염기구 편향 다중 전위 전구체(MPP)가 있는 전구체가 포함됩니다. 이 새로운 접근 방식은 적혈구 및 기타 조혈 전구 세포를 분석할 때 더 높은 정밀도를 허용하고 유세포 측정적으로 정의된 각 집단에 대한 전사체 정보를 참조할 수도 있습니다.
Introduction
적혈구 생성은 초기 적혈구 생성과 적혈구 말단 분화의 두 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다(그림 1)1,2,3. 초기 적혈구 생성에서 조혈 줄기 세포는 적혈구 계통에 전념하고 초기 적혈구 전구 세포를 생성하며, 이는 반고체 배지에서 집락 형성 잠재력을 기반으로 1970 년대에 처음 확인되었습니다 4,5,6,7,8,9 . 대체로 적혈구 전구 세포는 두 가지 범주로 나뉩니다 : 각각 “파열 형성 단위 적혈구”또는 BFU-e 4,5,6으로 명명 된 “파열”(더 작은 적혈구 세포 클러스터의 큰 집합체)을 일으키는 초기 전구 세포; 그리고 그들의 자손은 각각 “콜로니 형성 단위 적혈구” 또는 CFU-e 7,8,9로 명명된 하나의 작은 적혈구 세포 클러스터 또는 콜로니를 형성합니다. BFU-e 및 CFU-e는 아직 말단 적혈구 유전자를 발현하지 않으며 형태 학적으로 인식 할 수 없습니다. 다수의 자가 갱신 또는 확장 세포 분열 후, CFU-e는 글로빈과 같은 적혈구 유전자가 유도되는 전사 전환을 거쳐 적혈구 말단 분화(ETD)1,10로 전환됩니다. ETD 동안, 적혈구 세포는 적혈구로 성숙하는 망상 적혈구를 형성하기 전에 3-5 개의 성숙한 세포 분열을 거칩니다.
말단 분화 중 적혈구 세포는 원래 형태에 따라 전 적혈구 모세포, 호 염기성, 다색 성 및 직교 색성으로 분류되었습니다. 유세포분석법의 출현으로 세포 크기(순방향 산란, FSC로 측정)와 두 개의 세포 표면 마커인 CD71 및 Ter11911,12,13을 기반으로 전향적 분류 및 분리가 가능해졌습니다(그림 1). 이것과 유사한 유세포분석접근법(14)은 ETD의 분자 및 세포 측면의 조사에 혁명을 일으켜, 생체내 및 시험관내 10,15,16,17,18,19,20의 발달 단계 특이적 분석을 가능하게 한다. CD71/Ter119 접근법은 이제 적혈구 전구체 분석에 일상적으로 사용됩니다.
최근까지 마우스 조직에서 CFU-e 및 BFU-e의 직접적이고 고순도 전향적 분리를 위한 유사하고 접근 가능한 유세포측정 접근 방식은 연구자를 피했습니다. 대신에, 연구자들은 종종 동일한 유세포측정 서브세트21 내에서 공동-정제되는 비-적혈구 세포의 존재 하에서, 이들 전구세포의 일부만을 단리하는 유동 세포측정 전략을 사용하였다. 결과적으로, BFU-e 및 CFU-e의 조사는 초기 골수 전구 세포로부터 BFU-e 및 CFU-e를 유도하고 증폭하는 시험관 내 분화 시스템으로 제한되었다. 이어서, 이들 적혈구 전구세포-농축 배양물(22,23)에서 CFU-e와 BFU-e를 구별하는 유세포측정 전략을 적용하는 것이 가능하다. 대안적인 접근법은 태아 CFU-e 및 BFU-e를 사용하는데, 이는 임신 중기10,24,25에서 마우스 태아 간의 Ter119- 음성 분획에서 고도로 풍부합니다. 그러나 이러한 접근법 중 어느 것도 생체 내 생리적 상태에서 성인 BFU-e 및 CFU-e를 조사 할 수 없습니다. 도전의 규모는 콜로니 형성 분석에 기초하여, 이들 세포가 각각 단지 0.025% 및 0.3%의 빈도로 성인 골수에 존재한다는 것을 상기할 때 이해될 수있다6.
여기에 설명된 프로토콜은 새로 수확한 Kit+ 마우스 골수 세포의 단일 세포 전사체 분석을 기반으로 하는 새로운 유세포 분석 접근 방식입니다(키트는 골수의 모든 초기 전구 집단에서 발현됨)1. 우리의 접근법에는 Pronk et al.21,26에 의해 이미 사용되었던 일부 세포 표면 마커가 포함되어 있습니다. 단일 세포 전사체는 적혈구 및 기타 초기 조혈 전구 세포를 식별하는 세포 표면 마커의 조합을 결정하는 데 사용되었습니다 (그림 2). 특히, 계통 음성(Lin–) Kit+ 세포의 CD55+ 분획은 5개의 집단으로 세분될 수 있으며, 그 중 3개는 적혈구 궤적의 연속 세그먼트를 생성합니다(그림 2). 이들 집단 각각의 전사체 정체성은 정렬한 다음, scRNAseq 및 정렬된 단일 세포 전사체를 원래의 전사체 맵에 다시 투영하여 확인하였다(5개 집단 각각의 유전자 발현 및 전체 골수 데이터 세트는 https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html 에서 탐색할 수 있음)1 . 각 집단의 세포 운명 잠재력은 전통적인 콜로니 형성 분석(그림 2)과 새로운 고처리량 단일 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 확인되었습니다. 이러한 분석은 새로운 유세포 분석 접근법이 신선한 성인 골수 및 비장의 모든 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 고순도 분리를 초래한다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 집단 1(P1)은 CFU-e만 포함하고 다른 조혈 전구 세포는 포함하지 않으며, 집단 2(P2)는 골수의 모든 BFU-e 전구 세포와 소수의 CFU-e를 포함하지만 다른 선조1는 포함하지않는다. 아래의 상세한 프로토콜은 식염수 또는 적혈구 생성 자극 호르몬 인 에리스로포이에틴 (Epo)을 주사 한 마우스에서의 예제 실험으로 더 설명됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
BFU-e 및 CFU-e 전구 세포를 고순도의 신선한 조직에서 직접 전향 적으로 분리 할 수있는 능력은 이전에 연구자를 피했습니다. scRNAseq 및 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 검증된 당사의 새로운 접근법은 이제 이를 수행할 수 있는 도구를 제공합니다.
분류 프로토콜과 분석 프로토콜을 모두 성공적으로 실행하기 위한 몇 가지 핵심 사항?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 R01DK130498, R01DK120639 및 R01HL141402의 지원을 받습니다.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
Referencias
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