Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding
Summary
Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)
Abstract
Type drie secretiesystemen (T3SSs) stellen gramnegatieve bacteriën in staat om een batterij effectoreiwitten rechtstreeks in het cytosol van eukaryote gastheercellen te injecteren. Bij binnenkomst moduleren de geïnjecteerde effectoreiwitten coöperatief eukaryote signaalroutes en herprogrammeren ze cellulaire functies, waardoor bacteriële toegang en overleving mogelijk wordt. Het monitoren en lokaliseren van deze uitgescheiden effectoreiwitten in de context van infecties biedt een voetafdruk voor het definiëren van de dynamische interface van gastheer-pathogeen interacties. Het labelen en in beeld brengen van bacteriële eiwitten in gastheercellen zonder hun structuur / functie te verstoren, is echter technisch een uitdaging.
Het construeren van fluorescerende fusie-eiwitten lost dit probleem niet op, omdat de fusie-eiwitten het secretoire apparaat blokkeren en dus niet worden uitgescheiden. Om deze obstakels te overwinnen, hebben we onlangs een methode gebruikt voor locatiespecifieke fluorescerende etikettering van bacteriële uitgescheiden effectoren, evenals andere moeilijk te labelen eiwitten, met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE). Dit artikel biedt een compleet stap-voor-stap protocol om Salmonella uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van GCE site-specifiek, gevolgd door aanwijzingen voor het afbeelden van de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)
Recente bevindingen suggereren dat de opname van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) via GCE, gevolgd door bio-orthogonale etikettering met tetrazine-bevattende kleurstoffen, een levensvatbare techniek is voor selectieve etikettering en visualisatie van bacteriële uitgescheiden eiwitten en daaropvolgende beeldanalyse in de gastheer. Het doel van dit artikel is om een eenvoudig en duidelijk protocol te bieden dat kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van superresolutiebeeldvorming met behulp van GCE om verschillende biologische processen in bacteriën en virussen te bestuderen, evenals gastheer-pathogeen interacties.
Introduction
Bacteriële infecties worden al lang beschouwd als een ernstig gevaar voor de menselijke gezondheid. Pathogenen gebruiken hoogontwikkelde, extreem krachtige en ingewikkelde afweersystemen, evenals een verscheidenheid aan bacteriële virulentiefactoren (aangeduid als effectoreiwitten) om immuunresponsen van de gastheer te ontwijken en infecties vast te stellen 1,2. De moleculaire mechanismen die aan deze systemen ten grondslag liggen en de rol van individuele effectoreiwitten zijn echter nog grotendeels onbekend vanwege het gebrek aan geschikte benaderingen voor het direct volgen van de cruciale eiwitcomponenten en effectoren in gastheercellen tijdens pathogenese.
Een typisch voorbeeld is Salmonella enterica serovar Typhimurium, dat acute gastro-enteritis veroorzaakt. Salmonella Typhimurium maakt gebruik van type drie secretiesystemen (T3SS) om een verscheidenheid aan effectoreiwitten rechtstreeks in gastheercellen te injecteren. Zodra Salmonella de gastheercel binnenkomt, bevindt het zich in een zuur membraangebonden compartiment, de Salmonella-bevattende vacuole (SCV)3,4 genoemd. De zure pH van de SCV activeert het Salmonella pathogeniciteitseiland 2 (SPI-2)-gecodeerde T3SS en transloceert een volley van 20 of meer effectoreiwitten over het vacuolaire membraan in het gastheercytosol 5,6,7,8. In de gastheer manipuleren deze complexe cocktails van effectoreiwitten coördinerend de signaleringsroutes van gastheercellen, wat resulteert in de vorming van zeer dynamische, complexe buisvormige membraanstructuren die zich vanuit de SCV uitstrekken langs microtubuli, Salmonella-geïnduceerde filamenten (SIFs) genoemd, die Salmonella in staat stellen te overleven en zich te repliceren in de gastheercellen9,10,11.
Methoden om bacteriële effectorlokalisaties te visualiseren, te volgen en te monitoren, en hun handel en interacties in gastheercellen te onderzoeken, bieden kritisch inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan bacteriële pathogenese. Het labelen en lokaliseren van Salmonella uitgescheiden T3SS effector eiwitten in gastheercellen is een technologische uitdaging gebleken12,13; Niettemin heeft de ontwikkeling van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten ons vermogen om eiwitten in levende systemen te bestuderen en te visualiseren getransformeerd. De grootte van fluorescerende eiwitten (~25-30 kDa)15 is echter vaak vergelijkbaar met of zelfs groter dan die van het betreffende eiwit (POI; bijv. 13,65 kDa voor SsaP, 37,4 kDa voor SifA). In feite blokkeert fluorescerende eiwitetikettering van effectoren vaak de secretie van de gelabelde effector en blokkeert de T3SS14.
Bovendien zijn fluorescerende eiwitten minder stabiel en zenden ze een laag aantal fotonen uit vóór het fotobleken, waardoor hun gebruik in superresolutiemicroscopische techniekenwordt beperkt 16,17,18, met name in fotoactivatielokalisatiemicroscopie (PALM), STORM en gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Hoewel de fotofysische eigenschappen van organische fluorescerende kleurstoffen superieur zijn aan die van fluorescerende eiwitten, vereisen methoden / technieken zoals CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 en HA-Tags 24,25 een extra eiwit- of peptideaanhangsel dat de structuurfunctie van het effectoreiwit van belang kan schaden door te interfereren met posttranslationele modificatie of handel. Een alternatieve methode die noodzakelijke eiwitmodificatie minimaliseert, omvat de opname van ncAAs in een POI tijdens translatie via GCE. De ncAAs zijn fluorescerend of kunnen fluorescerend worden gemaakt via klikchemie 12,13,26,27,28.
Met behulp van GCE kunnen ncAAs met kleine, functionele, bio-orthogonale groepen (zoals een azide, cyclopropeen of cyclooctynegroep) op bijna elke locatie in een doeleiwit worden geïntroduceerd. In deze strategie wordt een inheems codon verwisseld met een zeldzaam codon zoals een amber (TAG) stopcodon op een bepaalde positie in het gen van de POI. Het gemodificeerde eiwit wordt vervolgens tot expressie gebracht in cellen naast een orthogonaal aminoacyl-tRNA-synthetase/tRNA-paar. De actieve tRNA-synthetaseplaats is ontworpen om slechts één bepaalde ncAA te ontvangen, die vervolgens covalent wordt bevestigd aan het 3′-uiteinde van het tRNA dat het ambercodon herkent. De ncAA wordt eenvoudig in het groeimedium ingebracht, maar het moet door de cel worden opgenomen en het cytosol bereiken waar het aminoacyl-tRNA-synthetase () het kan koppelen aan het orthogonale tRNA; het wordt vervolgens op de opgegeven locatie in de POI opgenomen (zie figuur 1)12. GCE maakt dus locatiespecifieke opname mogelijk van een overvloed aan bio-orthogonale reactieve groepen zoals keton, azide, alkyn, cyclooctyne, transcycloocteen, tetrazine, norboneen, α, β-onverzadigde amide en bicyclo [6.1.0]-nonyne in een POI, waardoor mogelijk de beperkingen van conventionele eiwitetiketteringsmethodenworden overwonnen 12,26,27,28.
Recente opkomende trends in beeldvormingstechnieken met superresolutie hebben nieuwe wegen geopend om biologische structuren op moleculair niveau te onderzoeken. In het bijzonder is STORM, een op lokalisatie gebaseerde techniek met één molecuul, superresolutie, een waardevol hulpmiddel geworden om cellulaire structuren tot ~ 20-30 nm te visualiseren en is in staat om biologische processen één molecuul per keer te onderzoeken, waardoor de rollen van intracellulaire moleculen worden ontdekt die nog onbekend zijn in traditionele ensemble-gemiddelde studies13 . Single-molecule en superresolutietechnieken vereisen een kleine tag met heldere, fotostabiele organische fluoroforen voor de beste resolutie. We hebben onlangs aangetoond dat GCE kan worden gebruikt voor het opnemen van geschikte sondes voor beeldvorming met superresolutie12.
Twee van de beste keuzes voor eiwitetikettering in cellen zijn bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) en trans-cycloocteen-lysine (TCO; weergegeven in figuur 1), die genetisch gecodeerd kunnen zijn met behulp van een variant van het tRNA / synthetase-paar (hier tRNA Pyl / PylRS AF genoemd), waarbijPyl pyrrolysine vertegenwoordigt enAF een rationeel ontworpen dubbele mutant (Y306A, Y384F) afgeleid van Methanosarcina mazei die van nature codeert voor pyrrolysine12, 29,30,31. Door de spanningsbevorderde inverse elektronenvraag Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC) reactie, reageren deze aminozuren chemoselectief met tetrazine conjugaten (Figuur 1)12,30,31. Dergelijke cycloadditiereacties zijn uitzonderlijk snel en compatibel met levende cellen; Ze kunnen ook fluorogeen zijn, als een geschikte fluorofoor is gefunctionaliseerd met het tetrazinedeel12,26,32. Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd protocol voor het monitoren van de dynamiek van bacteriële effectoren die in gastheercellen worden afgeleverd met behulp van GCE, gevolgd door subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen met behulp van dSTORM. De resultaten geven aan dat opname van een ncAA via GCE, gevolgd door een klikreactie met fluorogene tetrazine-dragende kleurstoffen, een veelzijdige methode is voor selectieve etikettering, visualisatie van uitgescheiden eiwitten en daaropvolgende subcellulaire lokalisatie in de gastheer. Alle componenten en procedures die hier worden beschreven, kunnen echter worden aangepast of vervangen, zodat het GCE-systeem kan worden aangepast om andere biologische vragen te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven aanpak werd gebruikt om de precieze locatie te volgen van effectoreiwitten die na infectie door de bacteriële T3SS in de gastheercel werden geïnjecteerd. T3SS’en worden gebruikt door intracellulaire pathogenen zoals Salmonella, Shigella es Yersinia om virulentiecomponenten in de gastheer te transporteren. De ontwikkeling van superresolutiebeeldvormingstechnologieën heeft het mogelijk gemaakt om virulentiefactoren te visualiseren met een voorheen onvoorstelbare resolutie<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door start-upfondsen van de University of Texas Medical branch, Galveston, TX, en een Texas STAR-prijs voor L.J.K. Wij danken Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Duitsland) voor plasmide pEVOL-PylRS-AF. Afbeeldingen in figuur 1 zijn gemaakt met BioRender.
Materials
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
Referencias
- Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
- Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
- Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
- Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
- Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
- Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
- Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
- Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
- Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
- Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
- Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
- Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
- Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
- Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
- Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
- Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
- Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
- Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
- Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
- Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
- Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
- Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
- Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).
