Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

遺伝暗号拡張を用いた細菌分泌タンパク質の超解像イメージング

Published: February 10, 2023

doi:

Moirangthem Kiran Singh, Linda J. Kenney

¹Biochemistry & Molecular Biology,University of Texas Medical Branch

Summary

この記事では、遺伝暗号拡大(GCE)部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識し、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在を画像化するための簡単で明確なプロトコルを提供します。

Abstract

タイプ3分泌システム(T3SS)は、グラム陰性菌が真核生物宿主細胞の細胞質ゾルに直接エフェクタータンパク質のバッテリーを注入することを可能にします。侵入すると、注入されたエフェクタータンパク質は真核生物のシグナル伝達経路を協調的に調節し、細胞機能を再プログラムして、細菌の侵入と生存を可能にします。感染の状況下でこれらの分泌されたエフェクタータンパク質をモニタリングおよび局在化することは、宿主-病原体相互作用の動的インターフェースを定義するためのフットプリントを提供します。しかし、宿主細胞内の細菌タンパク質の構造/機能を破壊することなく標識およびイメージングすることは技術的に困難です。

蛍光融合タンパク質を構築しても、融合タンパク質は分泌装置を詰まらせて分泌されないため、この問題は解決しません。これらの障害を克服するために、我々は最近、遺伝暗号拡張(GCE)を用いて、細菌分泌エフェクターやその他の標識が困難なタンパク質の部位特異的蛍光標識法を採用しました。この論文では、GCE部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識するための完全なステップバイステップのプロトコルを提供し、その後、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在をイメージングするための指示を提供します。

最近の知見は、GCE を介して 非標準アミノ酸(ncAA)を取り込み、続いてテトラジン含有色素による生体直交標識を行うことが、細菌分泌タンパク質の選択的標識と可視化、およびその後の宿主での画像解析のための実行可能な技術であることを示唆しています。この記事の目的は、GCEを使用して超解像イメージングを実施し、細菌やウイルスのさまざまな生物学的プロセス、および宿主と病原体の相互作用を研究することに関心のある研究者が採用できる、簡単で明確なプロトコルを提供することです。

Introduction

細菌感染症は長い間、人間の健康に対する深刻な危険と見なされてきました。病原体は、高度に進化し、非常に強力で複雑な防御システム、およびさまざまな細菌の病原性因子(エフェクタータンパク質と呼ばれる)を使用して、宿主の免疫応答を回避し、感染を確立します^1,2。しかし、これらの系の根底にある分子メカニズムと個々のエフェクタータンパク質の役割は、病因発生時に宿主細胞内の重要なタンパク質成分とエフェクターを直接追跡するための適切なアプローチが不足しているため、まだほとんど知られていません。

典型的な例の1つは、急性胃腸炎を引き起こすサルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィムリウムです。サルモネラチフィムリウムは、タイプ3分泌系(T3SS)を使用して、さまざまなエフェクタータンパク質を宿主細胞に直接注入します。サルモネラ菌が宿主細胞に入るとすぐに、サルモネラ菌含有液胞(SCV)^3,4と呼ばれる酸性膜結合コンパートメントに存在します。SCVの酸性pHは、サルモネラ病原性アイランド2(SPI-2)にコードされたT3SSを活性化し、液胞膜を横切って20以上のエフェクタータンパク質のボレーを宿主細胞質ゾル5,6,7,8に移動します。宿主内では、これらの複雑なエフェクタータンパク質のカクテルが宿主細胞のシグナル伝達経路を協調的に操作し、その結果、SCVから微小管に沿って伸びた非常にダイナミックで複雑な管状膜構造が形成され、サルモネラ菌誘発フィラメント(SIF)と呼ばれ、サルモネラ菌が宿主細胞内で生存および複製できるようになります9,10,11。

細菌のエフェクター局在を視覚化、追跡、モニタリングし、宿主細胞内での輸送と相互作用を調べる方法は、細菌の病因を支えるメカニズムへの重要な洞察を提供します。宿主細胞内でのサルモネラ菌分泌T3SSエフェクタータンパク質の標識と局在化は、技術的な課題であることが証明されています^12,13;それにもかかわらず、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の開発は、生体系内のタンパク質を研究し視覚化する私たちの能力を変えました。しかし、蛍光タンパク質のサイズ(~25-30 kDa)15は、多くの場合、目的のタンパク質のサイズと同等かそれ以上です(POI、例えば、SsaPの場合は^13.65 kDa、SifAの場合は37.4 kDa)。実際、エフェクターの蛍光タンパク質標識は、標識されたエフェクターの分泌を遮断し、T3SS¹⁴を詰まらせることがよくあります。

さらに、蛍光タンパク質は安定性が低く、光退色前に放出する光子の数が少ないため、超解像顕微鏡技術¹⁶、¹⁷、¹⁸^、特に光活性化局在顕微鏡(PALM)、STORM、および誘導放出枯渇(STED)顕微鏡での使用が制限されています。有機蛍光色素の光物性は蛍光タンパク質の光物性よりも優れていますが、CLIP/SNAP^19,20、Split-GFP 21、ReAsH/FlAsH 22,23、HA-Tags ^24,25などの方法/技術には、翻訳後修飾またはトラフィッキングを妨害することにより、目的のエフェクタータンパク質の構造機能を損なう可能性のある追加のタンパク質またはペプチド付加が必要です。必要なタンパク質修飾を最小限に抑える代替方法として、GCEを介した翻訳中にncAAをPOIに組み込む方法があります。ncAAは蛍光性であるか、またはクリックケミストリー12、¹³^、²⁶、²⁷^、²⁸を介して蛍光にすることができる。

GCEを使用すると、微小で機能的な生物学的直交基(アジド、シクロプロペン、シクロオクチン基など)を持つncAAを、標的タンパク質のほぼすべての場所に導入できます。この戦略では、ネイティブコドンは、POIの遺伝子内の指定された位置にあるアンバー(TAG)終止コドンなどのまれなコドンと交換されます。修飾されたタンパク質は、その後、直交アミノアシル-tRNA合成酵素/tRNAペアと一緒に細胞内で発現されます。tRNA合成酵素活性部位は、1つの特定のncAAのみを受け取るように設計されており、その後、アンバーコドンを認識するtRNAの3’末端に共有結合します。ncAAは単に増殖培地に導入されますが、細胞に取り込まれて細胞質ゾルに到達しなければならず、そこでアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)がそれを直交tRNAにリンクすることができます。その後、指定された位置のPOIに組み込まれます(図1を参照)¹²。したがって、GCEは、ケトン、アジド、アルキン、シクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジン、ノルボネン、α、β不飽和アミド、ビシクロ[6.1.0]-ノニンなどの多数の生体直交反応性基をPOIに組み込むことを可能にし、従来のタンパク質標識法の制限を克服する可能性があります12,26,27,28。

超解像イメージング技術の最近の新たなトレンドは、分子レベルで生物学的構造を調査するための新しい道を開きました。特に、1分子、局在化ベースの超解像技術であるSTORMは、~20-30 nmまでの細胞構造を可視化するための貴重なツールとなり、一度に1分子ずつ生物学的プロセスを調査することができ、従来のアンサンブル平均研究ではまだ知られていない細胞内分子の役割を発見しました¹³。.単一分子および超解像技術では、最高の分解能を得るために、明るく光安定性のある有機蛍光色素を含む小さなタグが必要です。我々は最近、GCEが超解像イメージングに適したプローブを組み込むために使用できることを実証^{しました12}。

細胞内のタンパク質標識のための最良の選択肢の2つは、ビシクロ[6.1.0]ノニネリジン(BCN)およびトランスシクロオクテン-リジン(TCO;図1に示す)であり、これらはtRNA/シンテターゼペアの変異体(ここではtRNA Pyl/^PylRS AFと呼ばれる)を使用して遺伝的にコードされている可能性があり、ここでPylはピロリジンを表し、^AFはピロリジン¹²を自然にコードするメタノサルシナマゼイに由来する合理的に設計された二重変異体(Y306A、Y384F)を表します^。 29,30,31。ひずみ促進逆電子要求ディールス・アルダー環化付加(SPIEDAC)反応により、これらのアミノ酸はテトラジン結合体と化学選択的に反応します(図1)12,30,31。このような環化付加反応は非常に速く、生細胞と互換性があります。それらはまた、適切なフルオロフォアがテトラジン部分¹²、²⁶、³²で官能化されている場合^、蛍光性であってもよい。この論文では、GCEを使用して宿主細胞に送達された細菌エフェクターのダイナミクスをモニタリングするための最適化されたプロトコルを提示し、その後、dSTORMを使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在をモニタリングします。この結果は、GCEを介したncAAの取り込みとそれに続く蛍光発生テトラジン含有色素とのクリック反応が、選択的標識、分泌タンパク質の可視化、およびその後の宿主における細胞内局在化のための汎用性の高い方法であることを示しています。ただし、ここで詳述するすべてのコンポーネントと手順は、GCEシステムを他の生物学的問題を調査するように調整または置換することができます。

Protocol

1. プラスミド構築 POIを発現する遺伝子を、大腸菌BL21(DE3)でPOIを発現する発現プラスミド(例えば、pET28a-sseJ 10TAG)にクローニングする。この工程は、変異体が機能的であるとの判定を容易にする。宿主細胞におけるサルモネラ菌分泌エフェクターの可視化のために、以前の報告7、12、24</sup…

Representative Results

このプロトコルペーパーでは、図1に示すように、サルモネラ菌分泌エフェクターの部位特異的蛍光標識と可視化のためのGCEベースの方法について説明します。トランスシクロオクテンバイオ直交基(TCO)を有するncAAと蛍光色素の化学構造を図1Aに示す。SseJ標識は、GCE技術を介した直交アミノアシル-tRNA合成酵素/…

Discussion

本明細書に記載のアプローチは、感染後に細菌T3SSによって宿主細胞に注入されたエフェクタータンパク質の正確な位置を追跡するために使用された。T3SSは、サルモネラ菌、赤痢菌、エルシニア菌などの細胞内病原体によって、病原性成分を宿主に輸送するために使用されます。超解像イメージング技術の開発により、これまで想像もできなかった解像度で病原性因子を?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、テキサス州ガルベストンのテキサス大学医学部からのスタートアップ資金と、L.J.K.へのテキサススター賞によってサポートされました。プラスミドpEVOL-PylRS-AFについて、Edward Lemke教授(欧州分子生物学研究所、ハイデルベルク、ドイツ)に感謝します。図1 の画像は、BioRenderを使用して作成されました。

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802

Referencias

Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).