Summary
开发了一种光片显微镜来对整个耳蜗进行成像和数字化。
Abstract
耳聋是最常见的感觉障碍，根据世界卫生组织1，全球约有5%或4.3亿人受到影响。衰老或老年性聋是感音神经性听力损失的主要原因，其特征是毛细胞、螺旋神经节神经元 （SGN） 和血管纹受损。这些结构位于耳蜗内，耳蜗具有复杂的螺旋形膜组织解剖结构，悬浮在液体中并被骨包围。这些特性使得研究和量化组织病理学变化在技术上变得困难。为了满足这一需求，我们开发了一种光片显微镜（TSLIM），可以对整个耳蜗进行成像和数字化，以促进内耳结构 - 功能关系的研究。整个耳蜗对齐良好的连续切片会产生一堆图像，用于三维 （3D） 体积渲染和单个结构的分割，以进行 3D 可视化和定量分析（即长度、宽度、表面、体积和数量）。耳蜗需要最少的处理步骤（固定、脱钙、脱水、染色和光学清除），所有这些都与随后通过扫描和透射电子显微镜进行的高分辨率成像兼容。由于所有组织都存在于堆栈中，因此可以单独评估每个结构或相对于其他结构进行评估。此外，由于成像使用荧光探针，免疫组织化学和配体结合可用于识别特定结构及其在耳蜗内的3D体积或分布。在这里，我们使用TSLIM检查老年小鼠的耳蜗，以量化毛细胞和螺旋神经节神经元的损失。此外，高级分析（例如聚类分析）用于可视化罗森塔尔管中螺旋神经节神经元沿其3D体积的局部减少。这些方法证明了TSLIM显微镜量化耳蜗内部和耳蜗之间结构 - 功能关系的能力。
Introduction
耳蜗是哺乳动物听力的周围感觉器官。它具有重复的感觉和支持细胞的复杂螺旋解剖结构，这些细胞在解剖学上专门用于检测声音振动并将其传输到大脑以进行听觉感知。主要的感觉元素是内毛细胞和外毛细胞及其神经支配神经纤维，其细胞体构成螺旋神经节，位于罗森塔尔管内（图1）。这些感觉和神经结构按张力排列，使得高频声音在耳蜗基底转导，低频声音在耳蜗顶点转导2。沿支撑基底膜螺旋长度的这种感觉细胞分布的解剖图称为细胞耳蜗图3 ，可以与听力损失进行比较，听力图中显示的频率是函数。
耳蜗的膜性迷宫被致密的骨头包围，这使得一次检查多个耳蜗结构在技术上变得困难。因此，开发光片显微镜的基本原理是产生完整耳蜗的对齐良好的连续切片，以便在3D重建中可以相对检查所有耳蜗结构。Voie等人4 和Voie和Spelman5 设计了第一台光片显微镜，称为正交平面荧光光学切片（OPFOS）显微镜，用于光学切片整个耳蜗。然而，这种显微镜从未商业化开发;因此，我们的目标是构建一种称为薄片激光成像显微镜（TSLIM; 图2）。TSLIM的设计和施工细节之前已经公布了8。TSLIM对OPFOS进行了多项改进，包括使用低光数码相机与CCD相机进行图像采集，光学编码微定位器使标本通过光片准确且可重复地移动，使用市售的光学透明标本室，以及罗丹明在乙醇而不是透明溶液中染色以防止染色剂在组织内沉淀。SPIM6 等光片显微镜的商业开发侧重于活体小型透明标本的高分辨率成像，但由于缺乏足够的工作距离，因此不适合整个耳蜗成像。Santi7发表了对其他光片显微镜开发的综述。与其他组织学方法相比，TSLIM检查耳蜗的主要优势是光学切片组织以进行3D重建，同时保持标本的完整性，以便其他组织学方法可以使用。TSLIM成像的另一个优点是，与共聚焦显微镜中暴露于激光的整个组织厚度相比，只有激光产生的薄光片暴露在组织中。组织清除以最大限度地减少光散射，并且只有一小部分组织暴露于激光的事实导致光片激光成像的荧光染料褪色（光漂白）最小。然而，与活组织相比，固定、脱水和清除过程确实会改变耳蜗结构的形态并导致组织萎缩。实际发生的组织萎缩量未确定。
TSLIM由Shane Johnson和八名德国光学工程专业学生开发（见致谢）。TSLIM结构细节由Santi等人提供8，扫描版本（sTSLIM）由Schröter等人9提供。TSLIM可用作无损切片机，用于光学切片标本，并用作显微镜，通过耳蜗的整个宽度和厚度收集2D连续切片。TSLIM可以对小（毫米）和大（厘米）的厚标本进行成像。镜头采用空气安装，可在解剖显微镜上进行较长的工作距离，收集物镜分别为1倍和2倍。解剖显微镜还具有变焦光学元件，使TSLIM能够解析细胞上的亚细胞和突触结构。TSLIM配备了蓝色（473 nm）和绿色（532 nm）激光进行照明，允许使用各种荧光探针进行成像。TSLIM的目标是通过整个耳蜗产生对齐良好的2D光学切片，以实现耳蜗组织的完整数字重建。由于它是一种荧光方法，配体和免疫组织化学也可用于鉴定特定的耳蜗结构。
最初，柱面透镜用于产生两个相对的高斯光片，但它会产生吸收成像伪影。由于Keller等人的工作10，固定柱面透镜被扫描振镜镜取代，以产生光片9。此外，由于光片的中心在光束腰部最薄，因此sTSLIM 2D图像是通过在样品宽度上收集X轴数据列的组合来生成的（图3）。这种方法首先由Buytaert和Dircks11描述。用于驱动和收集图像的TSLIM定制软件是使用用于仪器控制的图形程序开发的。光片穿过标本并照亮组织内的荧光平面。该荧光平面通过透明标本正交投射，并通过解剖显微镜收集。光学编码的微定位器允许扫描X轴上的光束腰部以收集单个复合2D图像，随后，Z轴微定位器将标本移动到组织内的更深平面，以获得一堆连续的切片2D图像（视频1， 图4）。在耳蜗的整个宽度、厚度和长度上收集一堆平移图像，不需要拼接图像（视频 2）。图像堆栈被传输到另一台计算机并加载到3D渲染程序中以进行3D重建和量化。图像堆栈包含有关显微镜分辨率下耳蜗形态的所有数字信息。然而，如果需要更高的分辨率，完整的耳蜗可以通过破坏性的组织学方法进一步处理，如切片机切片、扫描和透射电子显微镜。
3D渲染程序用于分割不同的耳蜗结构，以进行3D渲染和定量分析。对于分割，通过图形输入板和笔使用不同的颜色跟踪堆栈的每个 2D 图像中的每个结构（图 5）。迄今为止，已经对20种不同的耳蜗结构进行了分割（图6）。分割后，可以执行各种3D分析。例如，3D渲染软件可以在结构质心的任何平面上虚拟地切除耳蜗。 视频 3 显示了与 Corti 器官相切的切片，它显示了沿基底膜长度的毛细胞。此过程首先需要手动分割感兴趣的结构。接下来，根据沿结构中心从其底部到顶点放置的样条点的最小二乘拟合来计算结构的质心，从而允许近似结构的长度（视频 4）。一种称为骨架化的类似过程可用于使用颜色图可视化结构沿其长度的径向宽度（视频 4）。每个结构的总体积在分割后由程序计算，但相对距离也可以在 3D 渲染软件中使用彩色图进行量化和可视化（图 7）。还可以导出分段结构以生成放大的实体塑料模型渲染（图 8）。此外，还可以使用 3D 渲染软件进行半自动细胞计数（图 9）。免疫组织化学和配体结合可用于染色特定的耳蜗结构，这些结构可以与其他耳蜗结构分离，以进行形态学评估，例如产生细胞耳蜗图（图10）。所有耳蜗结构的长度、宽度、表面、体积和数量都可以从 3D 模型中确定，这使得这种方法非常适合将耳蜗损伤映射到功能障碍。具体来说，由于衰老、噪音引起的创伤或其他侮辱引起的耳蜗损伤可以在 2D 光学切片的 3D 耳蜗重建中显示和量化。一旦耳蜗被数字化，有许多成像算法可用于评估解剖登记处耳蜗内任何组织对其他耳蜗组织的耳蜗损伤。
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Protocol
所有程序和活体动物的使用均已由明尼苏达大学机构护理和使用委员会（IACUC）审查和批准（协议编号#2010-38573A），使用这些动物的研究人员在进入动物设施之前已经过研究动物资源（RAR）兽医的全面培训和测试。本研究均使用雄性和雌性小鼠。
1. 耳蜗去除固定和组织处理成像
- 使用CO2 吸入对小鼠实施安乐死。用剪刀将小鼠斩首，并通过大脑做一个背腹切口以使头骨半切。切除大脑，识别颅骨基底腹侧的圆形大疱，用圆疱打开大疱，观察并去除耳蜗。
- 固定：在通风橱下并使用解剖显微镜以5倍放大倍率执行此过程。戴手套和防护服。刺破椭圆形窗户并用锋利的镐取下镫骨。将镐插入圆窗以刺穿膜。
- 用连接到装有 2 mL 福尔马林的 1 mL 注射器的输液器的切口盖住打开的圆形窗口。在2分钟内通过耳蜗的外淋巴间隙缓慢注入福尔马林，注意福尔马林通过打开的椭圆形窗口 离开 耳蜗。修剪耳蜗上多余的组织，浸入含有10%福尔马林的瓶子中，然后放在旋转器上过夜。
- 脱钙：将耳蜗在PBS 3x中冲洗5分钟，然后浸入含有10%乙二胺四乙酸二钠溶液（EDTA）的瓶中旋转4天，每天更换溶液。
- 脱水：用PBS 3x灌注耳蜗，并在两次更换之间浸泡15分钟。用乙醇升序浓度10%，50%，70%，95%，95%，100%，100%使耳蜗脱水;每种浓度30分钟。
注意：在脱水前去除所有EDTA很重要，因为EDTA会在乙醇中沉淀。此外，耳蜗可以在任何浓度大于70%的乙醇中过夜。 - 染色：将整个耳蜗浸入异硫辛酸罗丹明B溶液（5μg/ mL在100%乙醇中）旋转过夜。用两次100%乙醇的变化从耳蜗中去除多余的染料，每次变化5分钟。
- 清除：将染色的耳蜗转移到两次变化的Spalteholz12 溶液（5：3水杨酸甲酯：苯甲酸苄酯）中，每次变化30分钟，并在澄清溶液中旋转放置过夜。耳蜗可以无限期地留在斯帕特霍尔茨溶液中。
2. 耳蜗成像
- 将耳蜗连接到椭圆形和圆形窗膜端的标本杆上，使清除溶液保留在耳蜗内并且不会形成气泡（图2）。必须注意不要让耳蜗内形成气泡，因为它们难以去除，如果留在组织中，它们会导致成像伪影。
- 使用紫外线活化胶将湿耳蜗连接到干标杆上（图2）。将耳蜗连接到椭圆形和圆形窗口末端。用紫外线在耳蜗周围移动，将紫外线胶固化10秒。
注意：耳蜗松动地连接到标本杆上会导致成像缺陷。该棒是专门为此协议制造的（有关详细信息，请参阅 Santi等人8），并且特定于我们的光片显微镜。 - 将耳蜗悬浮到装有Spalteholz溶液的成像室中进行成像。样品室是一个光学透明的石英荧光计电池（视频1）。
- 将试样杆连接到也连接到 XZ 平移台的旋转支架上。大多数堆栈是通过在XZ平面中平移试样获得的，但也可以获得旋转堆栈。
- TSLIM光学切片：根据荧光染料染色的类型，使用蓝色或绿色激光进行激发。将光片放置在组织的中间以进行聚焦，并确定将用于照亮耳蜗整个宽度的放大倍率。然后，使用定制设计的程序将标本穿过光片，在 X 轴上穿过标本（拼接图像）和 Z 步长，在整个耳蜗中制作一堆 2D 图像。
- 对于第一张图像，光片的光束腰部位于标本的边缘，程序扫描标本的整个宽度，收集数据列（参见图像拼接;Santi等人8）的宽度是共聚焦参数（图3）的宽度，以在整个标本宽度上产生最高分辨率的复合2D图像。该程序自动对每个 Z 步骤进行图像拼接，直到标本完全成像。
- 图像处理：将图像堆栈传输到另一台计算机，并将其加载到3D渲染程序中进行3D重建和量化。
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Representative Results
由于本期特刊的主题是成像耳蜗衰老的影响，因此将以年轻（3个月大，HS2479，CBA菌株小鼠）和老年（23个月大，HS2521，C57品系小鼠）耳蜗为例。应该注意的是，TSLIM能够对各种标本进行成像，包括来自人类，哺乳动物，其他啮齿动物和鱼类以及其他器官（例如大脑）的耳蜗。
Johnson等人13发表了一篇关于使用TSLIM在年轻（3周龄）CBA小鼠中加入SGN的文章。在五只小鼠中计数所有SGN，范围为8，408-8，912个SGN，平均罗森塔尔的长度为2.0毫米。在本研究中，我们计算了一只3个月大的CBA小鼠中的SGN，该小鼠在罗森塔尔运河长度为2.0毫米的长度中含有7，913个SGN。23个月大的C57BL6小鼠含有6，521 SGN，罗森塔尔的长度为2.11毫米。体积渲染显示两个耳蜗中的所有SGN，但在较老的小鼠中没有发现SGN丢失。然而，SGN细胞计数作为罗森塔尔管距离的函数，以线性图所示，与老年动物相比，耳蜗中端和顶端的年轻动物的SGN更大（图11）。通过在 3D 渲染软件中使用聚类分析，进一步可视化了 SGN 的这种明显损失。在这里，SGN密度差异被描绘在一个色标上，其中高密度簇是黄色的，蓝色代表低密度区域（图12）。虽然无法识别已经丢失的特定细胞，但聚类分析清楚地显示了沿罗森塔尔管长度的细胞密度较低的区域（图12）。
图 1：耳蜗的直接体积渲染。 来自小鼠耳蜗体积渲染的合成图，显示椭圆形 （O） 和圆形 （R） 窗口、带有毛细胞的 Corti 器官（蓝线，OC）和已分段的罗森塔尔管以及包含螺旋神经节神经元 （SGN） 的体积渲染。棒 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：试样支架。 定制标本支架的木制原型，用于使用紫外线活化胶将耳蜗（箭头）连接到标本杆（箭头），同时将清除溶液保持在耳蜗内。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：光片横截面。 通过X轴扫描光片的横截面，显示光片中间的光束腰部和共聚焦参数（CP），共聚焦参数（CP）是光束厚度相对恒定的区域。上面的实体渲染显示不扫描的光束宽度，下面的实体渲染显示扫描光束的宽度，该宽度在耳蜗的整个宽度上保持细。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：通过小鼠耳蜗的中模态 2D 横截面。 耳蜗转四次。可以看到罗森塔尔管的基底转弯包含球形螺旋神经节神经元。巴 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：耳蜗的两个横截面。 左侧是 2D 横截面，右侧是同一截面，其中包含使用不同颜色描摹分割的多个结构。棒 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：耳蜗结构分段。 （A）该图显示了带有周围耳囊的分段耳蜗。（B-K）这些显示了几种不同的耳蜗结构，这些结构已被分割，并且大多数结构的质心（白线）被确定。耳蜗结构已用不同的颜色进行分割以识别：（A）带骨的复合图形（白色），（B）绿松石（螺旋韧带），（C）栗色（血管纹），（D）黄色（基底膜），（E）红色（Corti器官），（F）黄绿色（罗森塔尔管），（G）蓝色（鼓室），金色（镫骨脚板），（H）白色（斯卡拉介质），绿色（导管），（I）红色（前庭）， 紫色（圆窗膜），金色（耳蜗导水管），（J）绿色（盖膜），（K）紫色（螺旋角膜）。棒 = 400 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图7：两种不同耳蜗中相同耳蜗结构的比较。 在3D渲染软件中使用Procrustus方法，比较了来自两个不同鼠标的Scala媒体。左面板显示了两个结构的最小二乘拟合的拟合，右面板使用颜色图显示了它们的定量差异。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：耳蜗的固体 3D 塑料模型。 左图显示了小鼠耳蜗的鼓膜Scala，基底膜，Corti器官和螺旋膜被分割。右侧面板显示了左侧结构的实体塑料模型。 请点击此处查看此图的大图。
图 9：螺旋神经节神经元计数。 SGN已被3D渲染软件程序在鼠标耳蜗的Scala介质横截面上识别和标记。 请点击此处查看此图的大图。
图10：外毛细胞的免疫组织化学标记。 通过小鼠耳蜗的淋巴周围Scala灌注的抗Prestin抗体和荧光二抗标记了使用3D渲染软件进行体积渲染的所有外毛细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图11：沿罗森塔尔运河长度的SGN密度。 SGN的最大损失似乎是在23个月大的小鼠的罗森塔尔运河的中端和顶端。 请点击此处查看此图的大图。
图 12：SGN 细胞密度的聚类分析。 左图显示了 3 个月大的正常听力小鼠中 SGN 的聚类分析。彩色图显示，给定大小的簇中细胞密度最大，位于罗森塔尔管中部，那里的小鼠听力阈值最低。右图显示了整个罗森塔尔运河中SGN的损失，其中罗森塔尔运河中部的SGN损失最大。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：耳蜗的X轴扫描视频。 通过光片对标本进行X轴扫描，显示由标本杆悬挂在玻璃室内的澄清溶液中的耳蜗。由于光片的照明，显示了耳蜗的正交二维荧光横截面。 请点击此处下载此视频。
视频2：耳蜗的连续切片堆叠。 通过X轴扫描和通过耳蜗的10μm Z步获得一小堆2D横截面。请注意整个堆栈中存在水平线，这是由于使用柱面透镜产生光片而导致的吸收伪影。 请点击此处下载此视频。
视频3：在不同平面上切除耳蜗。 加载到 3D 渲染软件程序中的堆栈，并在与 Corti 器官相切的平面上进行虚拟切除，显示沿基底膜长度的毛细胞。此视频已从8 修改而来。 请点击此处下载此视频。
视频4：Scala媒体的骨架化。 左图显示了小鼠耳蜗的 Scala 介质内质心的计算。右侧面板显示了 Scala 介质沿其长度的径向尺寸的彩色图。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
通过光片显微镜进行光学切片以检查耳蜗结构不像其他更传统的组织学方法那样具有机械破坏性，并且它提供了耳蜗结构相对于彼此的完整数字视图。以前的方法，如Corti14 器官的表面制备提供了沿基底膜长度的毛细胞损失图，但无法评估SGN损失，因为组织已被解剖以揭示Corti的器官。或者，耳蜗的中模态切片切片仅提供整个罗森塔尔管长度的SGN状况的非常小样本。使用TSLIM，所有耳蜗结构都在仪器的分辨率水平（即细胞下）数字化。耳蜗的完整图像堆栈允许对此处所示的多个耳蜗结构进行定量和可视化，这是传统组织学方法无法获得的。例如，使用聚类算法，本研究展示了一种全新的方法来查看和定量罗森塔尔管内的SGN细胞密度，并表征由于衰老引起的细胞损失（图12）。
TSLIM是光片显微镜的早期8 开发，其灵感来自Voie及其同事4，5的工作。TSLIM的建造规范由Santi等人8包含在论文中。事实上，Brown等人15 表示，他们根据TSLIM的设计构建了类似的光片显微镜，用于对耳蜗进行成像。正如引言中提到的，Santi7 对其他光片显微镜（例如SPIM）的开发旨在研究活细胞发育，并通过在标本室内浸入高N.A.物镜而获得更好的分辨率，这需要小的工作距离并且不适合对整个耳蜗进行成像。光片显微镜的商业开发仍在继续，这种类型的成像对于制备通过化学清除方法透明的组织和动物的对齐良好的连续切片非常有用。
对于任何光片显微镜应用，至关重要的是使标本透明以防止光散射和吸收。脱钙是从耳蜗中去除钙以实现透明度的第一步。如果在脱水前没有将EDTA从组织中完全冲洗出来，它将沉淀在组织内，并且无法进行良好的成像。乙醇脱水对于Spalteholz清除溶液的浸润是必要的。如果标本色素严重，则色素漂白可能有助于使标本更透明。还有许多其他化学品和方法可用于使试样透明，用户可能希望尝试不同的方法来确定哪种方法最适合他们的标本。尽管光片显微镜可产生组织的2D图像，但其分辨率不如从组织的薄机械切片（特别是塑料切片）和明场显微镜中获得的那么高。它的主要优点是产生对齐良好的连续组织切片，用于结构的3D重建。
我们作为衰老引起的SGN损失示例展示的两只小鼠耳蜗揭示了由于衰老而导致的神经元损失。一个意想不到的发现是耳蜗中端和顶端的SGN丢失，而不是与基部毛细胞损失相对应的基础损失。然而，我们没有评估这些耳蜗中的毛细胞损失，这两个样本只是例子，而不是对SGN衰老影响的研究。在White等人的一篇论文中，他们描述了18个月大的C57小鼠的SGN损失，但没有确定损失沿罗森塔尔运河长度的分布。在Grierson等人的另一篇论文中，17使用24-28个月大的小鼠，他们描述了OHC传出物的大规模变性，特别是在耳蜗的顶端，那里的OHCs也显着丢失。事实上，未来有很多可能性可以提取新数据，并更好地了解耳蜗内由于衰老和其他侮辱引起的病理过程。此外，人工耳蜗图像堆栈已提供给许多其他研究人员，看看这些研究人员如何挖掘数据以回答他们的研究问题将会很有趣。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国立卫生研究院国家耳聋和其他沟通障碍研究所，凯洛格基金会的资助，以及Bridget Sperl和John McCormick的私人捐款。TSLIM是在来自德国伊尔梅瑙技术大学的Matthias Hillenbrand，Kerstin John，Meike Lawin，Michel Layher，Tobias Schroeter，Peter Schacht，Oliver Dannberg和Julian Wuester的出色协助下开发的，由他们的导师（Stefan Sinzinger和Rene Theska）和James Leger监督。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
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