Summary
Se desarrolló un microscopio de hoja de luz para obtener imágenes y digitalizar toda la cóclea.
Abstract
La sordera es el deterioro sensorial más común, que afecta aproximadamente al 5% o 430 millones de personas en todo el mundo según la Organización Mundial de la Salud1. El envejecimiento o presbiacusia es una causa primaria de pérdida auditiva neurosensorial y se caracteriza por daño a las células ciliadas, las neuronas ganglionares espirales (SGN) y la estría vascular. Estas estructuras residen dentro de la cóclea, que tiene una anatomía compleja en forma de espiral de tejidos membranosos suspendidos en líquido y rodeados de hueso. Estas propiedades hacen que sea técnicamente difícil investigar y cuantificar los cambios histopatológicos. Para abordar esta necesidad, desarrollamos un microscopio de lámina de luz (TSLIM) que puede obtener imágenes y digitalizar toda la cóclea para facilitar el estudio de las relaciones estructura-función en el oído interno. Las secciones seriales bien alineadas de toda la cóclea dan como resultado una pila de imágenes para la representación tridimensional (3D) del volumen y la segmentación de estructuras individuales para la visualización 3D y el análisis cuantitativo (es decir, longitud, anchura, superficie, volumen y número). Las cócleas requieren pasos de procesamiento mínimos (fijación, descalcificación, deshidratación, tinción y limpieza óptica), todos los cuales son compatibles con imágenes posteriores de alta resolución mediante microscopía electrónica de barrido y transmisión. Dado que todos los tejidos están presentes en las pilas, cada estructura se puede evaluar individualmente o en relación con otras estructuras. Además, dado que las imágenes utilizan sondas fluorescentes, la inmunohistoquímica y la unión de ligandos se pueden utilizar para identificar estructuras específicas y su volumen o distribución 3D dentro de la cóclea. Aquí utilizamos TSLIM para examinar las cócleas de ratones envejecidos para cuantificar la pérdida de células ciliadas y neuronas ganglionares en espiral. Además, se utilizaron análisis avanzados (por ejemplo, análisis de conglomerados) para visualizar reducciones locales de neuronas ganglionares espirales en el canal de Rosenthal a lo largo de su volumen 3D. Estos enfoques demuestran la capacidad de la microscopía TSLIM para cuantificar las relaciones estructura-función dentro y entre las cócleas.
Introduction
La cóclea es el órgano sensorial periférico para la audición en los mamíferos. Tiene una compleja anatomía en espiral de células sensoriales y de soporte repetitivas que están anatómicamente especializadas para detectar vibraciones sonoras y transmitirlas al cerebro para la percepción de la audición. Los principales elementos sensoriales son las células ciliadas internas y externas y sus fibras nerviosas inervantes cuyos cuerpos celulares componen el ganglio espiral, que reside dentro del canal de Rosenthal (Figura 1). Estas estructuras sensoriales y neuronales están dispuestas tonotópicamente de tal manera que los sonidos de alta frecuencia se transducen en la base coclear y los sonidos de baja frecuencia se transducen en el ápice de la cóclea2. Un mapa anatómico de esta distribución celular sensorial a lo largo de la longitud en espiral de la membrana basilar de soporte se denomina citococleografía3 y se puede comparar con la pérdida auditiva en función de la frecuencia como se muestra en un audiograma.
El laberinto membranoso de la cóclea, que está rodeado de hueso denso, hace que sea técnicamente difícil examinar más de una estructura coclear a la vez. Por lo tanto, la razón para desarrollar un microscopio de lámina de luz es producir secciones seriadas bien alineadas de la cóclea completa para que todas las estructuras cocleares puedan examinarse entre sí en reconstrucciones 3D. Voie et al.4 y Voie y Spelman5 diseñaron el primer microscopio de lámina de luz, llamado microscopio de sección óptica de fluorescencia plana ortogonal (OPFOS), para seccionar ópticamente toda la cóclea. Sin embargo, este microscopio nunca fue desarrollado comercialmente; por lo tanto, nuestro objetivo era construir un microscopio de lámina de luz llamado microscopio de imagen láser de hoja delgada (TSLIM; Figura 2). Los detalles de diseño y construcción de TSLIM se han publicado anteriormente8. TSLIM realizó varias mejoras sobre el OPFOS, incluido el uso de una cámara digital con poca luz frente a una cámara CCD para la recolección de imágenes, microposicionadores codificados ópticamente para un movimiento preciso y reproducible de la muestra a través de la hoja de luz, el uso de una cámara de muestra ópticamente clara disponible comercialmente y la tinción de rodamina en etanol en lugar de en la solución de limpieza para evitar la precipitación de manchas dentro del tejido. El desarrollo comercial de microscopios de lámina de luz como SPIM6 se ha centrado en imágenes de alta resolución de pequeñas muestras transparentes vivas, pero no son adecuadas para imágenes cocleares completas ya que carecen de una distancia de trabajo adecuada. Una revisión del desarrollo de otros microscopios de lámina de luz fue publicada por Santi7. La principal ventaja de TSLIM sobre otros métodos histológicos para examinar la cóclea es seccionar ópticamente los tejidos para la reconstrucción 3D mientras se preserva la integridad de la muestra para que pueda ser utilizada por otros métodos histológicos. Otra ventaja de las imágenes TSLIM es que solo una lámina de luz delgada producida por un láser se expone al tejido, en comparación con la exposición del espesor del tejido completo al láser como en la microscopía confocal. La limpieza del tejido para minimizar la dispersión de la luz y el hecho de que solo una pequeña porción del tejido está expuesta al láser da como resultado un desvanecimiento mínimo del fluorocromo (fotoblanqueo) con imágenes láser de lámina de luz. Sin embargo, el proceso de fijación, deshidratación y limpieza altera la morfología de las estructuras cocleares y da como resultado la contracción del tejido en comparación con el tejido vivo. No se determinó la cantidad real de contracción del tejido que se produce.
TSLIM fue desarrollado por Shane Johnson y ocho estudiantes alemanes de ingeniería óptica (ver Agradecimientos). Los detalles de construcción de TSLIM fueron proporcionados por Santi et al.8 y una versión de escaneo (sTSLIM) por Schröter et al.9. TSLIM funciona como un microtomo no destructivo para seccionar ópticamente muestras y como un microscopio para recolectar secciones seriadas 2D a través de todo el ancho y grosor de la cóclea. TSLIM puede obtener imágenes de especímenes gruesos pequeños (mm) y grandes (cm). Las lentes están montadas en el aire para permitir largas distancias de trabajo con objetivos de recolección de 1x y 2x en un microscopio de disección. El microscopio de disección también tiene óptica de zoom que permite a TSLIM resolver estructuras subcelulares y sinápticas en las células. TSLIM está equipado con un láser azul (473 nm) y verde (532 nm) para la iluminación que permite utilizar una variedad de sondas fluorescentes para la obtención de imágenes. El objetivo de TSLIM es producir secciones ópticas 2D bien alineadas a través de una cóclea completa para una reconstrucción digital completa de los tejidos cocleares. Dado que es un método fluorescente, los ligandos y la inmunohistoquímica también se pueden utilizar para identificar estructuras cocleares específicas.
Inicialmente, se utilizó una lente cilíndrica para producir dos láminas de luz gaussianas opuestas, pero produjo artefactos de imágenes de absorción. Debido al trabajo de Keller et al.10, la lente cilíndrica fija fue reemplazada por un espejo galvanómetro de escaneo para producir la lámina de luz9. Además, dado que el centro de la hoja de luz es el más delgado en la cintura del haz, las imágenes 2D de sTSLIM se producen mediante la recopilación de un compuesto de columnas de datos del eje X a lo ancho de la muestra (Figura 3). Este método fue descrito por primera vez por Buytaert y Dircks11. El software personalizado TSLIM para conducir y recopilar imágenes se desarrolló utilizando un programa gráfico para el control del instrumento. La lámina de luz viaja a través de la muestra e ilumina un plano fluorescente dentro del tejido. Este plano fluorescente se proyecta ortogonalmente a través de la muestra transparente y se recoge mediante un microscopio de disección. Los microposicionadores codificados ópticamente permiten escanear a través de la cintura del haz en el eje X para recopilar una sola imagen 2D compuesta y, posteriormente, el microposicionador del eje Z mueve la muestra a un plano más profundo dentro del tejido para obtener una pila de imágenes 2D seccionadas en serie (Video 1, Figura 4). Se recopila una pila de imágenes traslacionales a través de todo el ancho, grosor y longitud de la cóclea, y no es necesario coser imágenes (Video 2). La pila de imágenes se transfiere a otra computadora y se carga en un programa de renderizado 3D para la reconstrucción y cuantificación 3D. Las pilas de imágenes contienen toda la información digital sobre la morfología de una cóclea a la resolución del microscopio. Sin embargo, si se requiere una resolución más alta, la cóclea intacta puede procesarse aún más mediante métodos histológicos destructivos como la sección de microtomos, el escaneo y la microscopía electrónica de transmisión.
El programa de renderizado 3D se utiliza para segmentar diferentes estructuras cocleares para renderizado 3D y análisis cuantitativo. Para la segmentación, cada estructura en cada imagen 2D de la pila se traza utilizando un color diferente mediante una tableta gráfica y un lápiz (Figura 5). Hasta la fecha, se han segmentado 20 estructuras cocleares diferentes (Figura 6). Después de la segmentación, se puede realizar una variedad de análisis 3D. Por ejemplo, el software de renderizado 3D puede resecar virtualmente la cóclea en cualquier plano a lo largo del centroide de la estructura. El video 3 muestra la sección tangencial al órgano de Corti, que revela las células ciliadas a lo largo de la membrana basilar. Este proceso requiere primero la segmentación manual de la estructura de interés. A continuación, el centroide de la estructura se calcula en función del ajuste de mínimos cuadrados de los puntos spline colocados a lo largo del centro de la estructura desde su base hasta su ápice, lo que permite una aproximación de la longitud de la estructura (Video 4). Un proceso similar llamado esqueletización se puede utilizar para visualizar el ancho radial de la estructura a lo largo de su longitud utilizando un mapa de color (Video 4). El volumen total de cada estructura es calculado por el programa después de la segmentación, pero las distancias relativas también se pueden cuantificar y visualizar con mapas de color en un software de renderizado 3D (Figura 7). Las estructuras segmentadas también se pueden exportar para producir representaciones de modelos de plástico sólido ampliadas (Figura 8). Además, el recuento semiautomático de células también se puede realizar utilizando software de renderizado 3D (Figura 9). La inmunohistoquímica y la unión al ligando se pueden utilizar para teñir estructuras cocleares específicas y estas estructuras pueden aislarse de otras estructuras cocleares para la evaluación morfométrica, como la producción de un citocleograma (Figura 10). La longitud, el ancho, la superficie, el volumen y el número de todas las estructuras cocleares se pueden determinar a partir de los modelos 3D, lo que hace que este enfoque sea ideal para mapear el daño coclear a las deficiencias funcionales. Específicamente, el daño coclear debido al envejecimiento, el trauma inducido por el ruido u otros insultos se pueden mostrar y cuantificar en reconstrucciones cocleares 3D a partir de secciones ópticas 2D. Una vez que una cóclea ha sido digitalizada, existen numerosos algoritmos de imagen que se pueden utilizar para evaluar el daño coclear de cualquier tejido dentro de la cóclea en el registro anatómico a otros tejidos cocleares.
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Protocol
Todos los procedimientos y el uso de animales vivos han sido revisados y aprobados (Protocolo ID # 2010-38573A) por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de la Universidad de Minnesota (IACUC) y los investigadores que usan estos animales han sido completamente entrenados y probados por los veterinarios de Recursos de Animales de Investigación (RAR) antes de que tengan acceso a las instalaciones para animales. Tanto ratones machos como hembras fueron utilizados en este estudio.
1. Extracción de cóclea para fijación y procesamiento de tejidos para imágenes
- Eutanasia a un ratón mediante inhalación deCO2 . Decapitar al ratón con tijeras y hacer una incisión dorsal-ventral a través del cerebro para hemisectar el cráneo. Retire el cerebro, identifique la bulla redonda en la parte baso-ventral del cráneo, abra la bulla con rongeurs y visualice y elimine la cóclea.
- Fijación: Realice este procedimiento bajo una campana extractora y usando un microscopio de disección a un aumento de 5x. Use guantes y ropa protectora. Perfore la ventana oval y retire el estribo con un pico afilado. Inserte un pico en la ventana redonda para perforar la membrana.
- Cubra la ventana redonda abierta con la punta cortada de un equipo de perfusión conectado a una jeringa de 1 ml llena con 2 ml de formalina. Infundir lentamente formalina a través de los espacios perilinfáticos de la cóclea durante un período de 2 minutos, observando que la formalina está saliendo de la cóclea a través de la ventana oval abierta. Recorte el exceso de tejido de la cóclea y sumérjalo en una botella que contenga 10% de formalina, y colóquelo en un rotador durante la noche.
- Descalcificación: Enjuague la cóclea en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una y sumérjala en una botella que contenga una solución al 10% de ácido etilendiaminotetraacético disódico (EDTA) con rotación durante 4 días, cambiando la solución diariamente.
- Deshidratación: Perfundir la cóclea con PBS 3x y sumergir durante 15 minutos entre cambios. Deshidratar la cóclea con concentraciones ascendentes de etanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; durante 30 min en cada concentración.
NOTA: Es importante eliminar todo el EDTA antes de la deshidratación, ya que el EDTA precipita en etanol. Además, las cócleas se pueden dejar en cualquier concentración de etanol superior al 70% durante la noche. - Tinción: Teñir toda la cóclea por inmersión en una solución de isotiocinato de rodamina B (5 μg/mL en etanol al 100%) durante la noche con rotación. Eliminar el exceso de colorante de la cóclea con dos cambios de etanol al 100%, 5 min cada cambio.
- Aclaramiento: Transfiera la cóclea teñida a dos cambios de solución de Spalteholz12 (salicilato de metilo 5:3:benzoato de bencilo), 30 min cada cambio y déjelo durante la noche en la solución de aclaramiento con rotación. Las cócleas se pueden dejar en la solución de Spalteholz indefinidamente.
2. Imágenes de las cócleas
- Fije las cócleas a una varilla de muestra en el extremo de la membrana de la ventana ovalada y redonda para que la solución de limpieza permanezca dentro de la cóclea y no se formen burbujas (Figura 2). Se debe tener cuidado de no dejar que se formen burbujas dentro de la cóclea, ya que son difíciles de eliminar y, si se dejan en el tejido, causarán artefactos de imagen.
- Use un pegamento activador UV para unir la cóclea húmeda a la varilla de la muestra seca (Figura 2). Coloque la cóclea en los extremos ovalados y redondos de las ventanas. Cure el pegamento UV durante 10 s moviéndose alrededor de la cóclea con la luz UV.
NOTA: Una fijación suelta de la cóclea a la varilla de la muestra dará lugar a defectos de imagen. Esta varilla está fabricada específicamente para este protocolo (ver Santi et al.8 para más detalles) y es específica para nuestro microscopio de lámina de luz. - Suspenda la cóclea en la cámara de imágenes llena con solución de Spalteholz para la obtención de imágenes. La cámara de la muestra es una celda fluorómetro de cuarzo ópticamente transparente (Video 1).
- Fije la varilla de la muestra a un soporte giratorio que también esté conectado a la etapa de traslación XZ. La mayoría de las pilas se obtienen traduciendo la muestra en los planos XZ, pero también se pueden obtener pilas rotacionales.
- Sección óptica TSLIM: Utilice un láser azul o verde para la excitación dependiendo del tipo de tinción de fluorocromo. Coloque la lámina de luz en el centro del tejido para enfocar y determine el aumento que se utilizará para iluminar todo el ancho de la cóclea. Luego, use un programa diseñado a medida para mover la muestra a través de la hoja de luz a través de la muestra en el eje X (cosiendo la imagen) y en pasos Z para hacer una pila de imágenes 2D en toda la cóclea.
- Para la primera imagen, la cintura del haz de la hoja de luz se coloca en el borde de la muestra y el programa escanea todo el ancho de la muestra recolectando columnas de datos (ver costura de imagen; Santi et al.8) que son el ancho del parámetro confocal (Figura 3) para producir una imagen 2D compuesta de máxima resolución a lo ancho de la muestra. El programa automatiza la costura de imágenes para cada paso Z hasta que la muestra esté completamente fotografiada.
- Procesamiento de imágenes: Transfiera la pila de imágenes a otra computadora y cárguela en un programa de renderizado 3D para la reconstrucción y cuantificación 3D.
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Representative Results
Dado que el tema de este número especial es la imagen de los efectos del envejecimiento en la cóclea, se usarán como ejemplos una cóclea joven (ratón de cepa CBA de 3 meses de edad, HS2479, ratón de cepa CBA) y envejecida (23 meses de edad, HS2521, ratón cepa C57). Cabe señalar que TSLIM es capaz de obtener imágenes de una variedad de especímenes, incluidas cócleas de humanos, mamíferos, otros roedores y peces, así como otros órganos como el cerebro.
Johnson et al. 13 publicaron un artículo sobre SGNs en ratones CBA jóvenes (3 semanas de edad) usando TSLIM. Todos los SGN se contaron en cinco ratones y hubo un rango de 8,408-8,912 SGN con una longitud promedio de Rosenthal de 2.0 mm. En el presente estudio, contamos los SGN en un ratón CBA de 3 meses de edad que contenía 7.913 SGN en una longitud de canal de Rosenthal de 2,0 mm. El ratón C57BL6 de 23 meses de edad contenía 6.521 SGN con una longitud de Rosenthal de 2,11 mm. Una representación de volumen muestra todos los SGN en ambas cócleas, pero la pérdida de SGN no se reveló en el ratón más antiguo. Sin embargo, los recuentos de células SGN en función de la distancia del canal de Rosenthal, representados en una gráfica lineal, mostraron mayores SGN en el animal más joven en los extremos medio y apical de la cóclea en comparación con el animal más viejo (Figura 11). Esta aparente pérdida de SGN se visualizó aún más mediante el uso de análisis de clúster en software de renderizado 3D. Aquí, las diferencias de densidad de SGN se representaron en una escala de color donde los grupos de alta densidad son amarillos y el azul representa regiones de menor densidad (Figura 12). Aunque no es posible identificar células específicas que se han perdido, el análisis de conglomerados visualiza claramente regiones de menor densidad celular a lo largo del canal de Rosenthal (Figura 12).
Figura 1: Representación directa del volumen de una cóclea. Una figura compuesta de una representación de volumen de una cóclea de ratón que muestra las ventanas ovaladas (O) y redondas (R), órgano de Corti con células ciliadas (línea azul, OC) y el canal de Rosenthal que ha sido segmentado y volumen renderizado que contiene neuronas ganglionares espirales (SGN). Barra = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Portamuestras. Un prototipo de madera de un portamuestras personalizado para la fijación de la cóclea (punta de flecha) a una varilla de muestra (flecha) utilizando pegamento activado por UV mientras se mantiene la solución de limpieza dentro de la cóclea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Sección transversal de la hoja de luz. Una sección transversal a través de una hoja de luz escaneada del eje X que muestra la cintura del haz en el centro de la hoja de luz y el parámetro confocal (CP), que es una región donde el grosor del haz es relativamente constante. La representación sólida superior muestra el ancho del haz sin escaneo y la representación sólida inferior muestra el ancho del haz escaneado que permanece delgado en todo el ancho de la cóclea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Una sección transversal 2D midodiolar a través de una cóclea de ratón. Se seccionan cuatro vueltas cocleares. El giro basal del canal de Rosenthal se puede ver que contiene neuronas ganglionares espirales de forma esférica. Barra = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Dos secciones transversales de la cóclea. A la izquierda hay una sección transversal 2D y a la derecha está la misma sección con varias estructuras que se han segmentado utilizando trazados de diferentes colores. Barra = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Estructuras cocleares segmentadas. (A) Esta figura muestra una cóclea segmentada con la cápsula ótica circundante. (B-K) Estos muestran varias estructuras cocleares diferentes que han sido segmentadas y los centroides (línea blanca) están determinados para la mayoría de las estructuras. Las estructuras cocleares se han segmentado con diferentes colores para su identificación: (A) figura compuesta con hueso (blanco), (B) turquesa (ligamento espiral), (C) granate (stria vascularis), (D) amarillo (membrana basilar), (E) rojo (órgano de Corti), (F) amarillo-verde (canal de Rosenthal), (G) azul (scala tympani), dorado (estribo de pie), (H) blanco (scala media), verde (ductus reuniens), (I) rojo (scala vestibuli), púrpura (membrana de ventana redonda), oro (acueducto coclear), (J) verde (membrana tectorial), (K) púrpura (limbo espiral). Barra = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Comparación de la misma estructura coclear en dos cócleas diferentes. Utilizando el método Procrustus en el software de renderizado 3D, se han comparado los medios Scala de dos ratones diferentes. El panel izquierdo muestra el ajuste de un ajuste de mínimos cuadrados de dos estructuras y el panel derecho muestra sus diferencias cuantitativas utilizando un mapa de color. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Modelo de plástico 3D sólido de la cóclea. El panel izquierdo muestra el tímpano de la Scala de una cóclea de ratón con la membrana basilar, el órgano de Corti y el helicotrema segmentados. El panel derecho muestra un modelo de plástico sólido de las estructuras de la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Conteo de neuronas ganglionares en espiral. Los SGN han sido identificados y marcados por el programa de software de renderizado 3D en una sección transversal de los medios Scala de la cóclea del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Marcaje inmunohistoquímico de células ciliadas externas. Los anticuerpos antiprestina y los anticuerpos secundarios fluorescentes que se perfundieron a través de la Scala perilinfática de una cóclea de ratón han marcado todas las células ciliadas externas que se han renderizado en volumen utilizando software de renderizado 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Densidad de SGNs a lo largo del canal de Rosenthal. La mayor pérdida de SGN parece estar en los extremos medio y apical del canal de Rosenthal en el ratón de 23 meses de edad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: Análisis de conglomerados de densidad celular SGN. El panel izquierdo muestra un análisis de conglomerados de SGN en un ratón con audición normal de 3 meses de edad. Un mapa de color muestra que la mayor densidad de células dentro de un grupo de un tamaño dado se encuentra en el canal de Rosenthal medio, donde los umbrales de audición del ratón son más bajos. El panel derecho muestra la pérdida de SGN en todo el canal de Rosenthal con la mayor pérdida de SGN en el medio del canal de Rosenthal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Video de escaneo del eje X de la cóclea. Escaneo del eje X de la muestra a través de la hoja de luz que muestra la cóclea suspendida por la varilla de la muestra en la solución de limpieza que está contenida dentro de una cámara de vidrio. Se muestra una sección transversal fluorescente 2D ortogonal de la cóclea debido a la iluminación de la lámina de luz. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Pila de secciones seriadas de la cóclea. Se obtiene una pila corta de secciones transversales 2D mediante escaneo del eje X y pasos Z de 10 μm a través de la cóclea. Observe la presencia de líneas horizontales en toda la pila, que son artefactos de absorción debido al uso de una lente cilíndrica para producir la lámina de luz. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 3: Resección de una cóclea en un plano diferente. Una pila cargada en el programa de software de renderizado 3D y resección virtual en un plano tangencial al órgano de Corti que muestra las células ciliadas a lo largo de la membrana basilar. Este video ha sido modificado de8. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 4: Skeletonization of the Scala media. El panel izquierdo muestra el cálculo del centroide dentro del medio Scala de una cóclea de ratón. El panel derecho muestra un mapa de color de las dimensiones radiales de los medios Scala a lo largo de su longitud. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
La sección óptica por microscopía de lámina de luz para el examen de estructuras cocleares no es mecánicamente destructiva como otros métodos histológicos más tradicionales, y proporciona una visión digital completa de las estructuras cocleares entre sí. Los métodos anteriores, como las preparaciones superficiales del órgano de Corti14 , proporcionaron un mapa de la pérdida de células ciliadas a lo largo de la membrana basilar, pero la pérdida de SGN no pudo evaluarse ya que el tejido había sido diseccionado para revelar el órgano de Corti. Alternativamente, las secciones de microtomo modoilar medio de la cóclea proporcionan solo una muestra muy pequeña de la condición de los SGN a lo largo del canal de Rosenthal. Con TSLIM, todas las estructuras cocleares se digitalizan a nivel de la resolución del instrumento (es decir, subcelular). Las pilas de imágenes completas de la cóclea permiten la cuantificación y visualización de múltiples estructuras cocleares, que se muestran aquí, que no podrían obtenerse mediante métodos histológicos tradicionales. Por ejemplo, utilizando un algoritmo de agrupamiento, la presente investigación mostró una forma completamente nueva de ver y cuantificar la densidad celular SGN dentro del canal de Rosenthal y caracterizar la pérdida celular debido al envejecimiento (Figura 12).
TSLIM es un desarrollo temprano8 de un microscopio de lámina de luz que se inspiró en el trabajo de Voie y colegas 4,5. Las especificaciones para la construcción de TSLIM fueron incluidas en el artículo de Santi et al.8. De hecho, Brown et al.15 afirmaron que construyeron un microscopio de lámina de luz similar para obtener imágenes de la cóclea basándose en el diseño de TSLIM. Como se mencionó en la Introducción y fue revisado por Santi7, el desarrollo de otros microscopios de lámina de luz (por ejemplo, SPIM) se dirigió a investigar el desarrollo de células vivas y obtuvo una mejor resolución mediante la inmersión de objetivos de alta N.A. dentro de la cámara de muestras, que requirió pequeñas distancias de trabajo y no es adecuado para obtener imágenes de cócleas completas. El desarrollo comercial de microscopios de lámina de luz continúa, y este tipo de imágenes es extremadamente útil para preparar secciones en serie bien alineadas de tejidos y animales transparentes mediante métodos de limpieza química.
Para cualquier aplicación de microscopio de lámina de luz, es fundamental que la muestra se haga transparente para evitar la dispersión y absorción de la luz. La descalcificación es el primer paso en el proceso para eliminar el calcio de la cóclea para mayor transparencia. Si el EDTA no se enjuaga completamente del tejido antes de la deshidratación, precipitará dentro del tejido y no será posible obtener buenas imágenes. La deshidratación por etanol es necesaria para la infiltración de la solución de limpieza de Spalteholz. Si una muestra está muy pigmentada, entonces el blanqueamiento del pigmento puede ayudar a que la muestra sea más transparente. Hay muchos otros productos químicos y métodos que se pueden utilizar para hacer que una muestra sea transparente y los usuarios pueden desear probar diferentes métodos para determinar qué método es el más adecuado para su muestra. Aunque la microscopía de lámina de luz produce imágenes 2D de tejido, su resolución no es tan grande como se puede obtener de secciones mecánicas delgadas de tejido (especialmente secciones de plástico) y microscopía de campo claro. Su principal ventaja es producir secciones seriadas de tejido bien alineadas para la reconstrucción 3D de estructuras.
Las dos cócleas de ratones que mostramos como ejemplos de pérdida de SGN debido al envejecimiento revelan pérdida de neuronas debido al envejecimiento. Un hallazgo inesperado fue la pérdida de SGNs en los extremos medio y apical de la cóclea en lugar de una pérdida basal que correspondería a una pérdida de células ciliadas en la base. Sin embargo, no evaluamos la pérdida de células ciliadas en estas cócleas y las dos muestras son simplemente ejemplos en lugar de una investigación de los efectos del envejecimiento en los SGN. En un artículo de White et al.16, describieron la pérdida de SGN en ratones C57 de 18 meses de edad, pero no determinaron la distribución de la pérdida a lo largo del canal de Rosenthal. En otro trabajo de Grierson et al.17, utilizando ratones de 24-28 meses de edad, describieron una degeneración masiva de las eferentes OHC, especialmente en la mitad apical de la cóclea, donde también hubo una pérdida significativa de OHC. De hecho, el futuro tiene muchas posibilidades para extraer nuevos datos y obtener una mejor comprensión de los procesos patológicos dentro de la cóclea debido al envejecimiento y otros insultos. Además, se han proporcionado pilas de imágenes cocleares a muchos otros investigadores y será interesante ver cómo estos investigadores extraen datos para responder a sus preguntas de investigación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Kellogg y donaciones privadas de Bridget Sperl y John McCormick. TSLIM ha sido desarrollado con la excelente asistencia de Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg y Julian Wuester de la Universidad Técnica de Illmenau, Alemania, bajo la supervisión de sus mentores (Stefan Sinzinger y Rene Theska) y James Leger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
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