Se desarrolló un microscopio de hoja de luz para obtener imágenes y digitalizar toda la cóclea.
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Artículo de método
Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz
En este artículo
Resumen
Resumen
La sordera es el deterioro sensorial más común, que afecta aproximadamente al 5% o 430 millones de personas en todo el mundo según la Organización Mundial de la Salud1. El envejecimiento o presbiacusia es una causa primaria de pérdida auditiva neurosensorial y se caracteriza por daño a las células ciliadas, las neuronas ganglionares espirales (SGN) y la estría vascular. Estas estructuras residen dentro de la cóclea, que tiene una anatomía compleja en forma de espiral de tejidos membranosos suspendidos en líquido y rodeados de hueso. Estas propiedades hacen que sea técnicamente difícil investigar y cuantificar los cambios histopatológicos. Para abordar esta necesidad, desarrollamos un microscopio de lámina de luz (TSLIM) que puede obtener imágenes y digitalizar toda la cóclea para facilitar el estudio de las relaciones estructura-función en el oído interno. Las secciones seriales bien alineadas de toda la cóclea dan como resultado una pila de imágenes para la representación tridimensional (3D) del volumen y la segmentación de estructuras individuales para la visualización 3D y el análisis cuantitativo (es decir, longitud, anchura, superficie, volumen y número). Las cócleas requieren pasos de procesamiento mínimos (fijación, descalcificación, deshidratación, tinción y limpieza óptica), todos los cuales son compatibles con imágenes posteriores de alta resolución mediante microscopía electrónica de barrido y transmisión. Dado que todos los tejidos están presentes en las pilas, cada estructura se puede evaluar individualmente o en relación con otras estructuras. Además, dado que las imágenes utilizan sondas fluorescentes, la inmunohistoquímica y la unión de ligandos se pueden utilizar para identificar estructuras específicas y su volumen o distribución 3D dentro de la cóclea. Aquí utilizamos TSLIM para examinar las cócleas de ratones envejecidos para cuantificar la pérdida de células ciliadas y neuronas ganglionares en espiral. Además, se utilizaron análisis avanzados (por ejemplo, análisis de conglomerados) para visualizar reducciones locales de neuronas ganglionares espirales en el canal de Rosenthal a lo largo de su volumen 3D. Estos enfoques demuestran la capacidad de la microscopía TSLIM para cuantificar las relaciones estructura-función dentro y entre las cócleas.
Introducción
La cóclea es el órgano sensorial periférico para la audición en los mamíferos. Tiene una compleja anatomía en espiral de células sensoriales y de soporte repetitivas que están anatómicamente especializadas para detectar vibraciones sonoras y transmitirlas al cerebro para la percepción de la audición. Los principales elementos sensoriales son las células ciliadas internas y externas y sus fibras nerviosas inervantes cuyos cuerpos celulares componen el ganglio espiral, que reside dentro del canal de Rosenthal (Figura 1). Estas estructuras sensoriales y neuronales están dispuestas tonotópicamente de tal manera que los sonidos de alta frecuen....
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Protocolo
Todos los procedimientos y el uso de animales vivos han sido revisados y aprobados (Protocolo ID # 2010-38573A) por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de la Universidad de Minnesota (IACUC) y los investigadores que usan estos animales han sido completamente entrenados y probados por los veterinarios de Recursos de Animales de Investigación (RAR) antes de que tengan acceso a las instalaciones para animales. Tanto ratones machos como hembras fueron utilizados en este estudio.
1. Extracción de cóclea para fijación y procesamiento de tejidos para imágenes
- Eutanasia a un ratón mediante inhalación deCO2....
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Resultados
Dado que el tema de este número especial es la imagen de los efectos del envejecimiento en la cóclea, se usarán como ejemplos una cóclea joven (ratón de cepa CBA de 3 meses de edad, HS2479, ratón de cepa CBA) y envejecida (23 meses de edad, HS2521, ratón cepa C57). Cabe señalar que TSLIM es capaz de obtener imágenes de una variedad de especímenes, incluidas cócleas de humanos, mamíferos, otros roedores y peces, así como otros órganos como el cerebro.
Johnson et al. 13 p.......
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Discusión
La sección óptica por microscopía de lámina de luz para el examen de estructuras cocleares no es mecánicamente destructiva como otros métodos histológicos más tradicionales, y proporciona una visión digital completa de las estructuras cocleares entre sí. Los métodos anteriores, como las preparaciones superficiales del órgano de Corti14 , proporcionaron un mapa de la pérdida de células ciliadas a lo largo de la membrana basilar, pero la pérdida de SGN no pudo evaluarse ya que el tejido había sido d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación ha sido apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Kellogg y donaciones privadas de Bridget Sperl y John McCormick. TSLIM ha sido desarrollado con la excelente asistencia de Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg y Julian Wuester de la Universidad Técnica de Illmenau, Alemania, bajo la supervisión de sus mentores (Stefan Sinzinger y Rene Theska) y James Leger.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Amira Software de renderizado 3D | ThermoFisher Scientific | Dirección: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzoato de bencilo (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Dirección: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% y 100% | Universidad de Minnesota | Dirección: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético sódico sódico sal dihidratado (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Programa gráfico LabVIEW y Vision | National Instruments | Dirección: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| salicilato de metilo (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Microscopio de disección Olympus MVX10 | Olympus Corp | Dirección: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Isotiocinato de rodamina B, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Dirección: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
Referencias
- Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J.....
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Reimpresiones y permisos
