Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína
Summary
Aquí, describimos un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles, seguido de las técnicas convencionales de pulldown para estudiar complejos de proteínas que no pueden ensamblarse in vitro.
Abstract
Pulldown es un ensayo de interacción proteína-proteína fácil y ampliamente utilizado. Sin embargo, tiene limitaciones en el estudio de complejos de proteínas que no se ensamblan eficazmente in vitro. Tales complejos pueden requerir ensamblaje co-traduccional y la presencia de chaperonas moleculares; O bien forman oligómeros estables que no pueden disociarse y volver a asociarse in vitro o son inestables sin un compañero de unión. Para superar estos problemas, es posible utilizar un método basado en la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles seguidos por las técnicas convencionales de pulldown. El flujo de trabajo es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional porque carece de los pasos que consumen mucho tiempo de purificación separada de proteínas que interactúan y su posterior incubación. Otra ventaja es una mayor reproducibilidad debido a un número significativamente menor de pasos y un período de tiempo más corto en el que las proteínas que existen dentro del ambiente in vitro están expuestas a proteólisis y oxidación. El método se aplicó con éxito para estudiar una serie de interacciones proteína-proteína cuando se descubrió que otras técnicas in vitro no eran adecuadas. El método se puede utilizar para probar por lotes las interacciones proteína-proteína. Se muestran resultados representativos para estudios de interacciones entre el dominio BTB y proteínas intrínsecamente desordenadas, y de heterodímeros de dominios asociados a dedos de zinc.
Introduction
El pulldown convencional es ampliamente utilizado para estudiar las interacciones proteína-proteína1. Sin embargo, las proteínas purificadas a menudo no interactúan eficazmente in vitro2,3, y algunas de ellas son insolubles sin su compañero de unión 4,5. Tales proteínas pueden requerir ensamblaje co-traduccional o la presencia de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Otra limitación del pulldown convencional es el ensayo de una posible actividad de heteromultimerización entre dominios que pueden existir como homooligómeros estables ensamblados co-traduccionalmente 8,10, ya que muchos de ellos no pueden disociarse y reasociarse in vitro durante el tiempo de incubación. La coexpresión fue encontrada útil para superar tales problemas 3,11. La coexpresión utilizando vectores compatibles en bacterias se utilizó con éxito para purificar grandes complejos macromoleculares de múltiples subunidades, incluido el complejo represivo polycomb PRC212, el módulo13 de la cabeza mediadora de la ARN polimerasa II, la placa base del bacteriófago T4 14, el módulo15,16 de la desubiquitinasa del complejo SAGA y la ferritina17. Los orígenes de replicación comúnmente utilizados para la coexpresión son ColE1, p15A18, CloDF1319 y RSF20. En el sistema de expresión Duet disponible comercialmente, estos orígenes se combinan con diferentes genes de resistencia a antibióticos y sitios de clonación múltiples convenientes para producir vectores policistrónicos, lo que permite la expresión de hasta ocho proteínas. Estos orígenes tienen diferentes números de copias y pueden ser utilizados en combinaciones variables para lograr niveles de expresión equilibrados de proteínas diana21. Para probar las interacciones proteína-proteína, se utilizan varias etiquetas de afinidad; las más comunes son 6xHistidina, glutatión-S-transferasa (GST) y proteína de unión a maltosa (MBP), cada una de las cuales tiene una afinidad específica con la resina correspondiente. GST y MBP también mejoran la solubilidad y estabilidad de las proteínas marcadas22.
También se han desarrollado varios métodos que involucran la coexpresión de proteínas en células eucariotas, el más destacado de los cuales es el ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H)23. El ensayo Y2H es barato, fácil y permite probar múltiples interacciones; sin embargo, su flujo de trabajo tarda más de 1 semana en completarse. También hay algunos ensayos basados en células de mamíferos menos utilizados, por ejemplo, el ensayo fluorescente de dos híbridos (F2H)24 y el ensayo de interacción proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)25. El ensayo F2H es relativamente rápido, lo que permite observar las interacciones de proteínas en su entorno celular nativo, pero implica el uso de costosos equipos de imágenes. Todos estos métodos tienen una ventaja sobre la expresión procariota que proporciona la traducción eucariota nativa y el entorno de plegado; Sin embargo, detectan la interacción indirectamente, ya sea por activación transcripcional o por transferencia de energía fluorescente, que a menudo produce artefactos. Además, las células eucariotas pueden contener otros socios de interacción de proteínas de interés, que pueden interferir con la prueba de interacciones binarias entre proteínas de eucariotas superiores.
El presente estudio describe un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente seguido de técnicas convencionales de pulldown. El método permite estudiar las interacciones entre proteínas diana que requieren coexpresión. Es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional, lo que permite la prueba por lotes de múltiples objetivos, lo que lo hace ventajoso en la mayoría de los casos. La coexpresión utilizando vectores compatibles es más conveniente que la coexpresión policistrónica, ya que no requiere un paso laborioso de clonación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito permite probar las interacciones proteína-proteína que no se pueden ensamblar eficientemente in vitro y requieren coexpresión. El método es uno de los pocos enfoques adecuados para estudiar proteínas heterodimerizantes, que también son capaces de homodimerización ya que, cuando se purifican por separado, tales proteínas forman homodímeros estables que con mayor frecuencia no pueden disociarse y volver a asociarse durante el experimento 3,11<sup clas…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los proyectos de la Fundación Rusa de Ciencias 19-74-30026 (desarrollo y validación de métodos) y 19-74-10099 (ensayos de interacción proteína-proteína); y por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia-subvención 075-15-2019-1661 (análisis de interacciones representativas proteína-proteína).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
Referencias
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