来自切除人肿瘤标本的 离体 器官型腹膜假粘液瘤肿瘤切片的培养和成像
Summary
我们描述了一种用于人类癌症的生产，培养和可视化的方案，这些癌症已经转移到腹膜表面。使用振动切片机切割切除肿瘤标本，并在可渗透的插入物上培养以增加氧合和活力，然后使用共聚焦显微镜和流式细胞术进行成像和下游分析。
Abstract
腹膜假黏液瘤 （PMP） 是一种罕见的疾病，由粘液原发性肿瘤的播散和分泌粘蛋白的肿瘤细胞在腹膜腔中积累引起。PMP可由各种类型的癌症引起，包括阑尾癌，卵巢癌和结直肠癌，尽管阑尾肿瘤是迄今为止最常见的病因。PMP由于其（1）罕见性，（2）有限的小鼠模型和（3）粘液，无细胞组织学，研究具有挑战性。这里介绍的方法允许在肿瘤微环境（TME）保持完整的制剂中使用患者来源的 离体 器官型切片对这些肿瘤类型进行实时可视化和询问。在该协议中，我们首先描述使用振动切片机制备肿瘤切片并随后进行长期培养。其次，我们描述了肿瘤切片的共聚焦成像以及如何监测活力、钙成像和局部增殖的功能读数。简而言之，切片装有成像染料，并放置在可以安装在共聚焦显微镜上的成像室中。延时视频和共聚焦图像用于评估初始活力和细胞功能。该程序还探索TME中的平移细胞运动和旁分泌信号传导相互作用。最后，我们描述了用于流式细胞术分析的肿瘤切片的解离方案。定量流式细胞术分析可用于从实验室到床边的治疗测试，以确定免疫景观和上皮细胞含量内发生的变化。
Introduction
腹膜假黏液瘤 （PMP） 是一种罕见综合征，发病率为每年每百万人 1 例1。大多数PMP病例是由阑尾肿瘤转移引起的。鉴于小鼠没有类似人类的阑尾，对这种类型的癌症进行建模仍然极具挑战性。虽然原发性疾病通常可以通过手术切除治愈，但转移性疾病的治疗选择有限。因此，开发这种新型器官型切片模型的基本原理是研究PMP的病理生物学。迄今为止，还没有可以永久培养的阑尾类器官模型;然而，最近的模型被证明可用于治疗剂和免疫疗法的药理学测试2。因此，我们采用了一种器官型切片培养系统，该系统已用于其他类型的人类癌症，例如脑癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等3，4，5，6。
除阑尾肿瘤外，PMP偶尔还由其他肿瘤类型引起，包括卵巢癌7，在极少数情况下，导管内状粘液肿瘤8 和结肠癌9。此外，这些肿瘤往往生长缓慢，在患者来源的异种移植（PDX）模型中移植率低10，11。鉴于这些挑战，开发模型来研究这种疾病的需求尚未得到满足，以开始了解PMP的病理生物学，以及这些癌细胞如何被招募到腹膜表面，增殖并逃避免疫监视。
虽然从体循环中切割出来，但肿瘤切片确实含有细胞和无细胞成分，包括细胞外基质、基质细胞、免疫细胞、癌细胞、内皮细胞和神经。这种半完整的微环境允许对这些细胞类型进行功能研究，与仅由癌细胞组成的3D类器官培养物相比，这是独特的优势12。虽然器官型切片培养在某些方面是有利的，但与可以扩增的3D类器官相比，它们本质上也是一种基于低通量的方法，适用于多重研究性治疗药物筛选13，14，15。就PMP而言，没有报告记录PMP衍生类器官的可靠建立和永久传代16。这可能是由于PMP衍生的肿瘤细胞生长缓慢，以及在这些粘液肿瘤中发现的恶性上皮细胞数量很少。鉴于需要开发模型来研究PMP，器官型切片特别适合研究这种疾病。我们提出了一种用于制备，成像和分析人类标本PMP的方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
本手稿描述了一种可用于培养、询问和分析人腹膜假黏液瘤 （PMP） 肿瘤标本的技术。我们利用了许多下游功能检测来询问肿瘤免疫微环境和从工作台到床边测试的平台。
虽然该方法在我们手中非常有效，但使用振动切片机切割肿瘤标本需要一些练习。也就是说，我们遇到了由于高度粘液的样品以及不正确地显微解剖以去除不可切割支架（腹壁，腹水，各种ECM蛋白）而导致的…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢摩尔斯癌症中心成像核心设施的Kersi Pestonjamasp对显微镜的帮助UCSD专业癌症支持中心P30资助2P30CA023100。这项工作还得到了JoVE出版补助金（JRW）的支持，以及伊丽莎白和Ad Creemers遗产，Euske家庭基金会，胃肠道癌症研究基金和腹膜转移研究基金（AML）的慷慨捐赠。
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
Referencias
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