절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징
Summary
우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.
Abstract
가성 점액종 복막종(PMP)은 점액성 원발성 종양의 파종과 그에 따른 복강 내 점액 분비 종양 세포의 축적으로 인해 발생하는 드문 질환입니다. PMP는 맹장암, 난소암, 결장직장암을 포함한 다양한 유형의 암에서 발생할 수 있지만 맹장 신생물이 단연코 가장 흔한 병인입니다. PMP는 (1) 희귀성, (2) 제한된 쥐 모델 및 (3) 점액성, 무세포 조직학으로 인해 연구하기 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 종양 미세 환경(TME)이 손상되지 않은 제제에서 환자 유래 생체 외 기관형 슬라이스를 사용하여 이러한 종양 유형을 실시간으로 시각화하고 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 비브라톰을 사용하여 종양 절편을 준비하고 후속 장기 배양을 설명합니다. 둘째, 종양 절편의 컨포칼 이미징과 생존력, 칼슘 이미징 및 국소 증식의 기능적 판독값을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 요컨대, 슬라이스에는 이미징 염료가 로드되고 컨포칼 현미경에 장착할 수 있는 이미징 챔버에 배치됩니다. 타임랩스 비디오와 컨포칼 이미지는 초기 생존력과 세포 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 이 절차는 또한 TME에서 번역 세포 이동 및 측분비 신호 상호작용을 탐구합니다. 마지막으로, 유세포 분석에 사용되는 종양 절편에 대한 해리 프로토콜을 설명합니다. 정량적 유세포 분석은 면역 환경 및 상피 세포 함량 내에서 발생하는 변화를 확인하기 위해 벤치 투 베드사이드 치료 테스트에 사용할 수 있습니다.
Introduction
복막가점액종(PMP)은 연간 발병률이 100만 명당 1명인 희귀 증후군입니다1. 대부분의 PMP 사례는 맹장 신생물의 전이로 인해 발생합니다. 생쥐가 인간과 같은 맹장을 가지고 있지 않다는 점을 감안할 때, 이러한 유형의 암을 모델링하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 원발성 질환은 종종 외과적 절제로 치료할 수 있지만 전이성 질환에 대한 치료 옵션은 제한적입니다. 따라서 이 새로운 기관형 절편 모델을 개발하는 근거는 PMP의 병리학을 연구하는 것입니다. 현재까지 영구적으로 배양할 수 있는 맹장 오가노이드 모델은 없습니다. 그러나, 최근의 모델은 치료제 및 면역요법의 약리학적 시험에 유용한 것으로 나타났다2. 따라서 우리는 뇌암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암 등과 같은 다른 유형의 인간 암에 사용된 기관형 절편 배양 시스템을 채택했습니다 3,4,5,6.
맹장 신생물 외에도 PMP는 난소암7을 포함한 다른 종양 유형에서 발생하는 경우도 있으며, 드물게 유두내 점액성 신생물8 및 결장암9을 유발한다. 또한, 이들 종양은 천천히 성장하는 경향이 있으며, 환자 유래 이종이식(PDX) 모델에서 생착률이 낮다(10,11). 이러한 문제를 감안할 때 PMP의 병리학을 이해하기 시작하고 이러한 암세포가 복막 표면으로 모집되고 증식하며 면역 감시를 피하는 방법을 이해하기 시작하기 위해 이 질병을 연구하기 위한 모델을 개발해야 할 미충족 요구가 있습니다.
전신 혈관 순환에서 절단되는 동안 종양 조각에는 세포외 기질, 기질 세포, 면역 세포, 암세포, 내피 세포 및 신경을 포함한 세포 및 무세포 구성 요소가 포함되어 있습니다. 이러한 반온전한 미세환경은 이러한 세포 유형의 기능적 조사를 가능하게 하며, 이는 암세포로만 구성된 3D 오가노이드 배양에 비해 유일하게 유리하다12. 기관형 절편 배양은 일부 측면에서 유리하지만, 확장이 가능한 3D 오가노이드에 비해 본질적으로 낮은 처리량 기반 접근 방식이며 다중 연구 치료 약물 스크리닝에 적합합니다13,14,15. PMP의 경우, PMP 유래 오가노이드16의 신뢰할 수 있는 확립 및 영구적인 계대배양을 문서화한 보고는 없었다. 이는 PMP 유래 종양 세포의 느린 성장 특성과 이러한 점액성 종양 내에서 발견되는 악성 상피 세포의 수가 적기 때문일 수 있습니다. PMP를 연구하기 위한 모델을 개발할 필요성을 감안할 때 기관형 절편은 이 질병을 연구하는 데 고유하게 적합합니다. 우리는 인간 표본에서 PMP를 준비, 이미징 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 인간 가성 점액종 복막종(PMP) 종양 표본을 배양, 심문 및 분석하는 데 사용할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 종양 면역 미세 환경과 벤치 투 베드사이드 테스트를 위한 플랫폼을 조사하기 위해 수많은 다운스트림 기능 분석을 활용했습니다.
이 방법은 우리 손에서 매우 효율적이지만 비브라톰을 사용하여 종양 표본을 절단하는 데는 약간의 연습이 필요합니다. …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 현미경 UCSD 전문 암 지원 센터 P30 보조금 2P30CA023100에 도움을 준 Moores Cancer Center 이미징 핵심 시설의 Kersi Pestonjamasp에게 감사를 표합니다. 이 작업은 JoVE 출판 보조금(JRW)과 Elisabeth 및 Ad Creemers의 유산, Euske 가족 재단, 위장암 연구 기금 및 복막 전이 연구 기금(AML)의 관대한 선물로 추가로 지원되었습니다.
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
Referencias
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