在 3D 类器官中模拟口腔-食管鳞状细胞癌
Summary
该协议描述了生成和表征鼠口腔 – 食管3D类器官的关键步骤，这些类器官代表通过化学致癌引起的正常，癌前和鳞状细胞癌病变。
Abstract
食管鳞状细胞癌（ESCC）在世界范围内普遍存在，每年占所有食管癌病例的90%，是所有人类鳞状细胞癌中最致命的。尽管最近在确定伴随ESCC启动和发展的分子变化方面取得了进展，但患者的预后仍然很差。这些分子变化的功能注释是必要的下一步，并且需要既能捕获ESCC的分子特征，又可以轻松且廉价地操作功能注释的模型。用烟草烟雾模拟物4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）处理的小鼠可预测地形成ESCC和食管癌前发育。值得注意的是，4NQO病变也出现在口腔中，最常见于舌头以及前胃，它们都共享分层鳞状上皮。然而，这些小鼠不能简单地操纵进行功能假设检验，因为生成同基因小鼠模型是时间和资源密集型的。在这里，我们通过从用4NQO处理的小鼠中生成单细胞衍生的三维（3D）类器官来克服这一限制，以表征小鼠ESCC或体 外肿瘤前细胞。这些类器官捕获了ESCC和食管癌前增生的显着特征，可以廉价快速地用于形成等基因模型，并可用于同源移植实验。我们演示了如何从正常，肿瘤前和SCC鼠食管组织中生成3D类器官，并维持和冷冻保存这些类器官。这些多功能类器官的应用非常广泛，包括利用基因工程小鼠和通过流式细胞术或免疫组织化学进一步表征，使用CRISPR技术生成同基因类器官系，以及药物筛选或同源移植。我们相信，广泛采用该议定书中展示的技术将加速该领域的进展，以应对ESCC的严重负担。
Introduction
食管鳞状细胞癌 （ESCC） 是人类鳞状细胞癌中最致命的，因为它诊断较晚、治疗耐药和转移1，2。ESCC 起源于分层鳞状上皮，其排列在食管的管腔表面。鳞状上皮由增殖性基底细胞和基底上细胞层内的分化细胞组成。在生理条件下，基底细胞表达标记物，如p63，Sox2和细胞角蛋白K5和K14，而分化的细胞表达K4，K13和IVL。基底细胞本身是异质的，包括由K153 和CD734等标记物定义的推定干细胞。在体内平衡中，基底细胞在基底上细胞层内经历有丝分裂后终末分化，而分化的细胞迁移并脱屑到腔内以完成上皮更新。让人联想到它们的起源细胞，ESCC在不同程度上显示出鳞状细胞分化。ESCC 通常伴有多灶性组织学前体病变，称为上皮内瘤变 （IEN） 或异型增生，包括非典型基底细胞。除了上皮变化外，ESCC还显示上皮下隔室内的组织重塑，其中发生癌症相关成纤维细胞（CAFs）的活化和免疫/炎症细胞的募集以促进肿瘤的微环境。
ESCC的发病机制涉及遗传改变和环境危险因素暴露。关键的遗传病变包括肿瘤抑制基因TP53和CDKN2A（p16INK4A）的失活以及CCND1（细胞周期蛋白D1）和EGFR癌基因的活化，最终导致细胞周期检查点功能受损，异常增殖以及在与暴露于环境致癌物相关的遗传毒性应激下存活。事实上，遗传变化与行为和环境风险因素密切相关，最常见的是烟草和酒精的使用。烟草烟雾中含有乙醛等人类致癌物质，乙醛也是酒精的主要代谢产物。乙醛诱导DNA加合物和链间DNA交联，导致DNA损伤和DNA突变和染色体不稳定的积累。鉴于过量的有丝分裂刺激和癌基因激活引起的异常增殖，应对遗传毒性应激的机制促进了食管上皮细胞的恶性转化，包括抗氧化剂的激活、自噬和上皮-间充质转化（EMT）。有趣的是，这些细胞保护功能通常在以高CD44（CD44H）表达为特征的ESCC癌症干细胞（CSC）中被激活，并具有肿瘤起始，侵袭，转移和治疗耐药的能力5，6，7。
ESCC已在细胞培养和啮齿动物模型8，9中建模。在过去的三十年中，已经开发出强大的ESCC基因工程小鼠模型。这些包括CCND1和EGFR转基因小鼠10，11和p53和p120Ctn敲除小鼠12，13。然而，单个基因改变通常不会导致快速发作的ESCC。通过使用食道致癌物克服了这一挑战，这些致癌物很好地概括了ESCC14中的人类遗传病变。例如，4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）加速CCND1转基因小鼠ESCC的发育15。近年来，在细胞谱系可追溯小鼠模型3，4中研究了假定的食管上皮干细胞，祖细胞及其各自的命运。此外，这些细胞谱系可追溯的小鼠已被用于探索ESCC的起源细胞以及这些细胞如何通过常规组织学和基于组学的分子表征产生CD44HCSCs7。
与这些小鼠模型相关的一个新兴领域是细胞培养技术在三维（3D）类器官系统中分析活ESCC和前体细胞的新应用，其中原始组织的结构在体外重现7，8，9。这些 3D 类器官从从小鼠组织中分离的单细胞悬液中快速生长，包括原发性和转移性肿瘤（例如淋巴结、肺和肝脏病变）。将细胞包埋在基底膜提取物（BME）中，并用明确的无血清细胞培养基进料。3D类器官在7-10天内生长，所得的球形结构适合传代培养，冷冻保存和测定，用于分析各种细胞特性和功能，包括CSC标志物，EMT，自噬，增殖，分化和凋亡细胞死亡。
这些方法可广泛应用于从任何分层鳞状上皮组织建立的3D类器官培养物，例如头颈部粘膜（口腔，舌头，咽部和喉部）甚至前胃。头颈部黏膜与食管相邻，两种组织具有相似的组织组织、功能和对疾病的易感性。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和ESCC都有遗传病变和生活方式相关的环境危险因素，如烟草和酒精暴露。强调这种相似性，用烟草烟雾模拟4NQO处理的小鼠很容易发展HNSCC和ESCC。鉴于下面描述的方案可以很容易地应用于HNSCC建模，我们提供了从这些病变建立3D类器官培养物的具体说明。
在本文中，我们提供了用于生成小鼠食管3D类器官（MEO）的详细方案，这些类器官代表在用4NQO治疗的小鼠中发展的正常，癌前和ESCC病变。可以使用各种小鼠品系，包括常见的实验室品系，如C57BL / 6和细胞谱系可追溯以及其他基因工程衍生物。我们强调关键步骤，包括分离正常或患病的小鼠食管上皮，制备单细胞悬浮液，培养和监测生长中的3D类器官，传代培养，冷冻保存以及后续分析的处理，包括形态学和其他应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的协议中，生成和分析MEO有几个关键步骤和注意事项。为了确保MEO实验的可重复性和严谨性，生物学和技术重复都很重要。对于生物学重复，每个实验条件通常有两到三只携带ESCC的独立小鼠就足够了。然而，适当的生物学重复次数可能会有所不同，具体取决于单个研究中要测试的参数。例如，目前尚不清楚从没有肉眼可见病变或组织学IEN和ESCC病变的4NQO处理小鼠中检测到肿瘤类器官的早?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心的共享资源（流式细胞术，分子病理学和共聚焦和专业显微镜）的技术支持。我们感谢Alan Diehl博士，Adam J. Bass博士和Kwok-Kin Wong博士（NCI P01食管癌发生机制）以及Rustgi和Nakagawa实验室的成员进行了有益的讨论。这项研究得到了以下NIH资助的支持：P01CA098101（H.N.和A.K.R.），R01DK114436（H.N.），R01AA026297（H.N.），L30CA264714（SF），DE031112-01（F.M.H.），KL2TR001874（F.M.H.），3R01CA255298-01S1（J.G.），2L30DK126621-02
（J.G.）R01CA266978 （C.L.）， R01DK132251 （C.L.）， R01DE031873 （C.L.）， P30DK132710 （C.M. 和 H.N.）， 和 P30CA013696 （AKR）。H.N.和C.L.是哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心多PI飞行员奖的获得者。H.N.是范可尼贫血研究基金奖的获得者。F.M.H.是马克癌症研究基金会奖（20-60-51-MOME）和美国癌症研究协会奖的获得者。J.G.是美国胃肠病学协会（AGA）奖的获得者。
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Referencias
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