3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング
Summary
このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。
Abstract
食道扁平上皮癌(ESCC)は世界中で蔓延しており、毎年すべての食道癌症例の90%を占め、すべてのヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です。ESCCの開始と発達に伴う分子変化の定義における最近の進歩にもかかわらず、患者の予後は依然として不良です。これらの分子変化の機能アノテーションは必要な次のステップであり、ESCCの分子的特徴を捉え、機能アノテーションのために簡単かつ安価に操作できるモデルが必要です。タバコ煙模倣体4-ニトロキノリン1-オキシド(4NQO)で治療されたマウスは、予想通りESCCおよび食道前腫瘍を形成する。注目すべきことに、4NQO病変は口腔、最も一般的には舌、および前胃にも発生し、これらはすべて層状扁平上皮を共有しています。ただし、これらのマウスは、同質遺伝子マウスモデルの生成に時間とリソースを大量に消費するため、機能仮説検証のために単純に操作することはできません。ここでは、マウスESCCまたは前腫瘍細胞を ex vivoで特徴付けるために、4NQOで処理したマウスから単一細胞由来の3次元(3D)オルガノイドを生成することにより、この制限を克服します。これらのオルガノイドは、ESCCおよび食道前新生物の顕著な特徴を捉え、安価かつ迅速に活用して同質モデルを形成することができ、同系移植実験に利用することができます。正常、腫瘍前、およびSCCマウス食道組織から3Dオルガノイドを生成し、これらのオルガノイドを維持および凍結保存する方法を示します。これらの汎用性の高いオルガノイドの用途は幅広く、遺伝子操作マウスの利用、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によるさらなる特性評価、CRISPR技術を使用した同系オルガノイド株の生成、薬物スクリーニングまたは同系移植が含まれます。このプロトコルで実証された技術の広範な採用は、ESCCの深刻な負担と戦うためのこの分野の進歩を加速すると信じています。
Introduction
食道扁平上皮癌(ESCC)は、診断の遅れ、治療抵抗性、および転移のために、ヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です1,2。ESCCは、食道の管腔表面を覆う層状扁平上皮から生じる。扁平上皮は、増殖性基底細胞と基底上細胞層内の分化細胞で構成されています。生理学的条件下では、基底細胞はp63、Sox2、サイトケラチンK5およびK14などのマーカーを発現し、分化細胞はK4、K13、およびIVLを発現します。基底細胞自体は不均一であり、K153およびCD734などのマーカーによって定義される推定幹細胞を含む。恒常性において、基底細胞は基底上細胞層内で有糸分裂後の終末分化を受けるのに対し、分化した細胞は内腔に移動して落屑し、上皮再生を完了する。ESCCは、それらの起源の細胞を彷彿とさせ、さまざまな程度で扁平上皮細胞の分化を示します。ESCCは、非定型基底細胞を含む上皮内腫瘍(IEN)または異形成として知られる多巣性組織学的前駆病変を伴うことがよくあります。上皮の変化に加えて、ESCCは上皮下コンパートメント内の組織リモデリングを示し、そこでは癌関連線維芽細胞(CAF)の活性化と免疫/炎症細胞の動員が起こり、腫瘍促進微小環境が促進されます。
ESCCの病因には、遺伝的変化と環境危険因子への曝露が含まれます。主な遺伝的病変には、腫瘍抑制遺伝子TP53およびCDKN2A(p16INK4A)の不活性化、およびCCND1(サイクリンD1)およびEGFR癌遺伝子の活性化が含まれ、細胞周期チェックポイント機能の障害、異常な増殖、および環境発がん物質への曝露に関連する遺伝毒性ストレス下での生存につながります。実際、遺伝的変化は、行動的および環境的危険因子、最も一般的にはタバコおよびアルコールの使用と密接に相互作用します。タバコの煙には、アルコールの主要な代謝物でもあるアセトアルデヒドなどの人間の発がん物質が含まれています。アセトアルデヒドはDNA付加体と鎖間DNA架橋を誘導し、DNA損傷とDNA変異の蓄積と染色体不安定性を引き起こします。過剰な分裂促進刺激と癌遺伝子活性化による異常な増殖を考えると、食道上皮細胞の悪性形質転換は、抗酸化剤の活性化、オートファジー、上皮間葉転換(EMT)などの遺伝毒性ストレスに対処するメカニズムによって促進されます。興味深いことに、これらの細胞保護機能は、高いCD44(CD44H)発現を特徴とし、腫瘍の開始、浸潤、転移、および治療抵抗性の能力を有するESCC癌幹細胞(CSC)においてしばしば活性化される5、6、7。
ESCCは、細胞培養およびげっ歯類モデルでモデル化されています8,9。過去30年間で、ESCCの堅牢な遺伝子操作マウスモデルが開発されました。これらには、CCND1およびEGFRトランスジェニックマウス10、11ならびにp53ならびにp120Ctonノックアウトマウス12、13が含まれる。ただし、単一の遺伝的変化は通常、急速に発症するESCCをもたらすことはありません。この課題は、ESCC14のヒトの遺伝的病変をよく再現する食道発がん物質の使用によって克服されました。例えば、4-ニトロキノリン-1-オキシド(4NQO)は、CCND1トランスジェニックマウスにおけるESCC発生を加速する15。近年、推定される食道上皮幹細胞、前駆細胞、およびそれらのそれぞれの運命が、細胞系譜追跡可能なマウスモデルにおいて研究されている3,4。さらに、これらの細胞系譜追跡可能なマウスは、ESCCの起源の細胞を探索し、そのような細胞が従来の組織学およびオミックスベースの分子特性評価を介してCD44H CSCをどのように生成するかを探索するために利用されています7。
これらのマウスモデルに関連する新たな分野の1つは、元の組織の構造がex vivoで再現される3次元(3D)オルガノイドシステムで生きたESCCおよび前駆細胞を分析するための細胞培養技術の新しい応用です7,8,9。これらの3Dオルガノイドは、原発性および転移性腫瘍(リンパ節、肺、肝臓の病変など)を含むマウス組織から単離された単一細胞懸濁液から急速に増殖します。細胞は基底膜抽出物(BME)に包埋され、明確に定義された無血清細胞培養培地が供給されます。3Dオルガノイドは7〜10日以内に成長し、得られた球状構造は、CSCマーカー、EMT、オートファジー、増殖、分化、アポトーシス細胞死など、さまざまな細胞特性と機能を分析するための継代培養、凍結保存、およびアッセイに適しています。
これらの方法は、頭頸部粘膜(口腔、舌、咽頭、喉頭)や前胃などの層状扁平上皮組織から確立された3Dオルガノイド培養に広く適用できます。頭頸部粘膜は食道と隣接しており、2つの組織は同様の組織組織、機能、および病気に対する感受性を共有しています。頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)とESCCの両方が、遺伝的病変と、タバコやアルコール曝露などのライフスタイル関連の環境リスク要因を共有しています。この類似性を強調すると、タバコ煙模倣体4NQOで処理されたマウスは、HNSCCとESCCの両方を容易に発症します。以下に説明するプロトコルをHNSCCのモデリングに簡単に適用できることを考慮して、これらの病変から3Dオルガノイド培養を確立するための具体的な手順が含まれています。
ここでは、4NQOで治療されたマウスで発生する正常、腫瘍前、およびESCC病変を表すマウス食道3Dオルガノイド(MEO)を生成するための詳細なプロトコルを提供します。C57BL/6などの一般的な実験株や、細胞系譜追跡可能なその他の遺伝子操作された誘導体など、さまざまなマウス系統を利用することができます。正常または罹患したマウス食道上皮の単離、単一細胞懸濁液の調製、増殖する3Dオルガノイドの培養とモニタリング、継代培養、凍結保存、形態やその他のアプリケーションを含むその後の分析のための処理など、重要なステップを強調しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルでは、MEO の生成と分析に関するいくつかの重要な手順と考慮事項があります。MEO実験の再現性と厳密性を確保するには、生物学的複製と技術的複製の両方が重要です。生物学的複製の場合、ESCCを有する2〜3匹の独立したマウスは、一般に、実験条件ごとに十分である。ただし、生物学的反復の適切な数は、個々の研究でテストするパラメーターによって異なる場合…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
コロンビア大学のハーバート・アーヴィング総合がんセンターの共有リソース(Flow Cytometry、Molecular Pathology、Confocal & Specialized Microscopy)の技術サポートに感謝する。Alan Diehl博士、Adam J. Bass博士、Kwok-Kin Wong博士(NCI P01食道発がんのメカニズム)とRustgi研究室とNakakawa研究室のメンバーに有益な議論をしていただき感謝します。この研究は、次のNIH助成金によってサポートされました:P01CA098101(H.N.およびA.K.R.)、R01DK114436(H.N.)、R01AA026297(H.N.)、L30CA264714(F.F.F.)、DE031112-01(F.M.H.)、KL2TR001874(F.M.H.)、3R01CA255298-01S1(J.G.)、2L30DK126621-02
(J.G.)R01CA266978 (C.L.)、R01DK132251 (C.L.)、R01DE031873 (C.L.)、P30DK132710 (C.M. および H.N.)、および P30CA013696 (別名)。H.N.とC.L.は、コロンビア大学ハーバートアーヴィング総合がんセンターMulti-PIパイロット賞を受賞しています。H.N.はファンコニ貧血研究基金賞を受賞しています。F.M.H.は、The Mark Foundation for Cancer Research Award(20-60-51-MOME)およびAmerican Association for Cancer Research Awardを受賞しています。J.G.は、米国消化器病学会(AGA)賞を受賞しています。
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Referencias
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