Menselijke mesenchymale stamcelverwerking voor klinische toepassingen met behulp van een gesloten semi-geautomatiseerde workflow

Summary

Hier presenteren we een protocol om aanhangende cellen uit meerlaagse kolven op een gesloten semi-geautomatiseerde manier te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatiesysteem. Dit protocol kan worden toegepast voor het oogsten van zowel adherente als suspensiecellen van andere celexpansieplatforms met weinig aanpassingen aan de bestaande stappen.

Abstract

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) worden momenteel onderzocht als een veelbelovende op cellen gebaseerde therapeutische modaliteit voor verschillende ziekten, met meer marktgoedkeuringen voor klinisch gebruik verwacht in de komende jaren. Om deze overgang te vergemakkelijken, is het van cruciaal belang om de knelpunten op het gebied van schaal, batch-to-lot reproduceerbaarheid, kosten, naleving van regelgeving en kwaliteitscontrole aan te pakken. Deze uitdagingen kunnen worden aangepakt door het proces af te sluiten en geautomatiseerde productieplatforms te gebruiken. In deze studie ontwikkelden we een gesloten en semi-geautomatiseerd proces voor het passeren en oogsten van Wharton’s jelly (WJ)-afgeleide hMSCs (WJ-hMSCs) uit meerlaagse kolven met behulp van tegenstroomcentrifugatie. De WJ-hMSCs werden uitgebreid met behulp van regelgevingsconform serumvrij xenovrij (SFM XF) medium, en ze toonden vergelijkbare celproliferatie (populatieverdubbeling) en morfologie als WJ-hMSCs uitgebreid in klassieke serumbevattende media. Ons gesloten semi-geautomatiseerde oogstprotocol toonde een hoog celherstel (~ 98%) en levensvatbaarheid (~ 99%). De cellen gewassen en geconcentreerd met behulp van tegenstroomcentrifugatie handhaafden WJ-hMSC-oppervlaktemarkerexpressie, kolonievormende eenheden (CFU-F), trilineagedifferentiatiepotentiaal en cytokinesecretieprofielen. Het semi-geautomatiseerde celoogstprotocol dat in de studie is ontwikkeld, kan eenvoudig worden toegepast voor de kleinschalige tot middelgrote verwerking van verschillende hechtende en suspensiecellen door rechtstreeks verbinding te maken met verschillende celexpansieplatforms om volumereductie, wassen en oogsten uit te voeren met een laag uitgangsvolume.

Introduction

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) zijn een geweldige kandidaat voor klinische toepassingen, zowel in tissue engineering als in celtherapieën, gezien hun therapeutisch potentieel en hoge zelfvernieuwingspotentieel om in vitro te groeien, die van cruciaal belang zijn voor het genereren van klinisch relevante doseringen van cellen ^1,2,3. Volgens ClinicalTrials.gov zijn er momenteel meer dan 1.000 klinische onderzoeken in onderzoek voor verschillende aandoeningen⁴. Gezien de toenemende belangstelling voor het gebruik van hMSC’s, zijn er in de nabije toekomst meer klinische onderzoeken en marktgoedkeuringen op handen ^5,6. De productie van hMSCs heeft echter veel inherente uitdagingen in termen van batch-to-batch variabiliteit, het gebruik van risicovolle grondstoffen, zorgen over verontreiniging als gevolg van vele open en handmatige processen, omdat de productie meerdere eenheidsbewerkingen omvat, hogere arbeidskosten, de kosten van opschalen of opschalen, en regelgevende hindernissen 6,7,8,9,10^{, 11,12}. Deze kwesties blijven een belangrijke belemmering voor de huidige en toekomstige markttoegang.

De ontwikkeling van gesloten, modulaire, geautomatiseerde productieoplossingen en het gebruik van hulpreagentia met een laag risico zouden deze uitdagingen aanpakken. Dit zou ook zorgen voor een consistente productkwaliteit, de kans op batchfouten als gevolg van menselijke fouten verminderen, de arbeidskosten verlagen en de processtandaardisatie en naleving van de regelgeving verbeteren, zoals in termen van digitale batchregistratie 8,12,13,14. Om een klinisch relevante dosering van cellen te kunnen verkrijgen, of het nu gaat om autologe of allogene, gestroomlijnde productie waarbij upstream celexpansie en downstream verwerking op een gesloten, geautomatiseerde manier plaatsvindt, is cruciaal.

Voor upstream hMSC-uitbreiding zijn de twee meest gebruikte productiemethoden momenteel scale-out (2D-monolaag) en opschaling (3D-microcarrier-gebaseerd ophangsysteem)^15,16,17,18. De meest traditionele en meest gebruikte methode voor hMSC-uitbreiding is 2D-monolayer-gebaseerde cultuur vanwege de lage productiekosten en het gemak van installatie¹⁹.

Meerlaagse kolven bestaande uit trays met een plat oppervlak die in een kweekvat zijn gestapeld, worden vaak gebruikt om de hMSC-productie op te schalen. Deze systemen worden meestal geleverd in 1-laags tot 40-laags kweekvaten²⁰ en worden handmatig behandeld in bioveiligheidskasten. De verwerkingsstappen tijdens het passeren en oogsten van cellen omvatten het handmatig doseren en decanteren van de expansiemedia, dissociatiereagens en wasbuffer door pipetteren of fysiek kantelen van het hele vat. Bovendien is het hanteren van meerdere eenheden uitdagend en tijdrovend vanwege hun enorme omvang en gewicht.

Vervolgens zijn naoogsten uit meerlaagse kolven, centrifugeren voor media-uitwisseling, celwassen en volumereductie essentiële stappen in de gehele celproductieworkflow²¹. Conventionele benchtopcentrifugatie is een meestal open en handmatig proces dat een groot aantal stappen omvat, zoals het overbrengen van de celsuspensie in afgedekte buizen of flessen in een bioveiligheidskast, het draaien van de cellen, het handmatig aanzuigen van het supernatant, celresuspensie met de buffer en herhaalde celwasbeurten. Dit verhoogt zowel het risico op besmetting door het openen en sluiten van de doppen als de kans op verlies van de celpellet tijdens het handmatige aspiratie- / pipetteerproces^{drastisch 22}. In de context van het hanteren van meerlaagse kweeksystemen voor op aanhang gebaseerde cellen zoals hMSC’s, zou de operator een moeizaam proces moeten doorlopen van herhaaldelijk pendelen tussen de centrifuge en de bioveiligheidskast en tegelijkertijd het hanteren van een zware eenheid. Deze handmatige stappen zijn arbeidsintensief, brengen risico’s met zich mee in termen van menselijke fouten en verontreiniging en moeten worden uitgevoerd in een klasse B cleanroom-omgeving, wat kostbaar is²³. Bovendien is het conventionele handmatige centrifugeerproces niet schaalbaar en kan het cellulaire afschuiving en spanning veroorzaken; Het maximaliseren van celherstel, levensvatbaarheid en de uitspoelefficiëntie van resterende onzuiverheden zijn dus andere grote uitdagingen²². Commerciële cGMP-schaalproductie van celtherapieën vereist gesloten, modulaire automatiseringsoplossingen om het risico op besmetting te verminderen, een consistente productkwaliteit te garanderen, arbeids- en productiekosten te verlagen en de procesbetrouwbaarheid te verhogen^24,25. Meerlaagse kolven kunnen als een gesloten systeem worden behandeld door een steriel filter van 0,2 μm in een van de poorten te hebben om steriele gasuitwisseling te vergemakkelijken en een tweede poort aseptisch verbonden via connectoren of buisgelast rechtstreeks op een geautomatiseerd celverwerkingsinstrument voor celoogst. We hebben gewerkt aan het sluiten en automatiseren van de meeste stappen van WJ-hMSC passaging en harvesting door een innovatieve gesloten tegenstroomcentrifuge te evalueren die bedoeld is voor de productie van cel-, gen- of weefselgebaseerde producten. Deze tegenstroomcentrifuge heeft ook de flexibiliteit om een verscheidenheid aan celverwerkingstoepassingen uit te voeren, zoals celscheiding op basis van grootte, medium / bufferuitwisseling, concentratie en oogsten voor een verscheidenheid aan celtypen 8,26,27,28. Het instrument maakt gebruik van een gesloten kit voor eenmalig gebruik die steriel kan worden aangesloten met behulp van buislassen of aseptische connectoren om zakken over te brengen of rechtstreeks kan worden aangesloten op elk uitbreidingsplatform naar keuze.

In deze studie hebben we een aangepaste buisassemblage ontworpen om gesloten steriele verbindingen mogelijk te maken tussen de tegenstroomcentrifugatiekit voor eenmalig gebruik en de meerlaagse kolf. We hebben een protocol geoptimaliseerd om WJ-MSC’s enzymatisch los te maken, te wassen en te oogsten van de meerlaagse kolf op een volledig gesloten en semi-geautomatiseerde manier binnen één run. De geoogste WJ-hMSCs werden gekarakteriseerd voor zuiverheid (oppervlaktemarkeranalyse) en potentie (CFU-F, trilineagedifferentiatie en cytokinesecretieprofielen) om ervoor te zorgen dat het eindproduct voldeed aan de kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) voor partijvrijgave.

Protocol

1. Bereiding van de kweekmedia en coating van de kweekvaten MediavoorbereidingSamenstelling van het klassieke serumbevattende medium: Bereid het klassieke serumbevattende medium door αMEM (445 ml), foetaal runderserum (FBS) (50 ml) en 100x penicilline-streptomycine (5 ml) te mengen. Bereid het volledige SFM XF-medium voor.Maak een fles van 500 ml door aseptisch 5 ml SFM XF-supplement (100x) en 5 ml 100x L-alanyl-L-glutamine (zie materiaaltabellen) toe te voegen aan het SFM XF-basaal medium (500 ml). Maak een mediazak van 2 L door aseptisch 20 ml aangepast MSC SFM XF-supplement (100x) en 20 ml 100x L-alanyl-L-glutamine (zie materiaaltabellen) toe te voegen aan de SFM XF basale medium zak (2 L) door een spuit van 50 ml aan te sluiten op de juiste poort van de zak.OPMERKING: Voeg voor gebruik in cultuur groeifactoren of cytokines (niet meegeleverd met het medium) toe aan het volledige SF XF-medium: PDGF-BB (20 ng / ml), FGF base (4 ng / ml) en TGFβ (0, 5 ng / ml). Coating van de celkweekvaten met vitronectine voor gebruik met serumvrije mediaOntdooi een voorraad vitronectine (VTN-N; 0,9 mg/ml) bij 4 °C. Gebruik steriele Dulbecco’s gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (DPBS) om de ontdooide VTN-N te verdunnen tot een werkconcentratie van 5 μg / ml.OPMERKING: Verdun de VTN-N onmiddellijk voor gebruik en bewaar de verdunde vitronectine-oplossing niet. Voeg 1 ml/10 cm2 van de verdunde VTN-N-oplossing toe aan het overeenkomstige kweekvat; De uiteindelijke concentratie is 0,5 μg/cm2. Voeg bijvoorbeeld 7,5 ml verdunde VTN-N-oplossing toe aan een T-75-kolf (75 cm2); voeg 17,5 ml verdunde VTN-N-oplossing toe aan een T-175-kolf (175 cm2); voeg 250 ml verdunde VTN-N-oplossing toe aan een standaard vierlaagse meerlaagse kolf (2,528 cm2); en voeg 630 ml verdunde VTN-N-oplossing toe aan een 10-laagse meerlaagse kolf (6.320 cm2). Incubeer de vaten onder steriele omstandigheden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).OPMERKING: Het gecoate kweekvat kan maximaal 1 week in 4 °C worden bewaard. Wikkel het kweekvat met laboratoriumfolie om uitdroging te voorkomen. Verwarm het kweekvat voor gebruik gedurende ten minste 1 uur voor op kamertemperatuur. Zuig de VTN-N-oplossing op, gooi deze weg en voeg onmiddellijk een voldoende volume kweekmedium toe om te voorkomen dat het gecoate vatoppervlak uitdroogt.OPMERKING: Het is niet nodig om het kweekvat af te spoelen na het verwijderen van de VTN-N. 2. WJ-hMSC uitbreiding Ontdooi WJ-hMSCs (p2) snel door de cryovial in een waterbad van 37 °C te plaatsen; Draai de injectieflacon langzaam rond totdat de inhoud begint te ontdooien. Zaai bij het ontdooien de WJ-hMSCs bij 5.000 cellen/cm 2 in een T-175-kolf (zonder VTN-N-coating) en incubeer in het klassieke serumbevattende medium bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 voor celexpansie. Na twee passages (p4) worden de geëxpandeerde cellen in het gewenste cryopreservatiemedium als een werkende celbank (WCB) neergezet. Voer celtelling uit met behulp van een geautomatiseerde celteller volgens de levensvatbaarheids- en celtellingsmethode om het totale celgetal, de levensvatbaarheid van de cel en de celgroottete bepalen 29. Kweek vanaf p4 de WJ-hMSCs bij 5.000 cellen/cm2 in T-75-kolven in klassiek serumbevattend medium of SFM XF-medium (gebruik VTN-N-gecoate kolven met SFM XF-medium). Houd de cellen in beide kweekmedia gedurende in totaal drie passages (12 dagen) en meet de celexpansie (vouwtoename) bij elke passage door het aantal levensvatbare cellen geteld aan het einde van de cultuur van elke passage te delen door het aantal levensvatbare cellen aan het begin van de cultuur (dag van celzaaien). 3. Seed train scale-out uitbreiding WJ-hMSC expansie in een T-175 kolfOntdooi de WJ-hMSCs bij p4 snel door de cryovial in een waterbad van 37 °C te plaatsen; Draai de injectieflacon langzaam rond totdat de oplossing begint te ontdooien. Zaai 5.000 cellen/cm2 in een VTN-N-gecoate T-175 kolf. Laat de cellen groeien in een incubator bij 37 °C met 5% CO2. Vervang het gebruikte kweekmedium elke 2-3 dagen door vers bereid voorverwarmd compleet SFM XF-medium voor optimale prestaties en celgroei. Behandeling van de meerlaagse kolven (figuur 1A, B)Alle aseptische verbindingen moeten in een steriele omgeving worden uitgevoerd. Pak de meerlaagse kolf uit in een biologische veiligheidskast. Sluit het voorgesteriliseerde luchtfilter (0,2 μm) aan op één poort om druk vrij te laten komen tijdens de vloeistofoverdracht met behulp van de tegenstroomcentrifuge. Plaats de meerlaagse kolfconnector van de aangepaste slangenset in de andere poort (figuur 1B). Las de PVC-lijn van de aangepaste buizenset aan de 2 L PVC-transferzak met volledig SFM XF-medium.OPMERKING: Meng de medium zak volledig voordat u deze toevoegt aan het meerlaagse systeem door zwaartekrachtstroom. Zorg ervoor dat de PVC-transferzak hoger hangt dan de meerlaagse kolf. Plaats de meerlaagse kolf op de lange zijde, met het luchtfilter aan de bovenkant (figuur 1B). Open de klem op de PVC-buis om te beginnen met het vullen van de meerlaagse kolf. Zorg ervoor dat het medium tijdens het vullen waterpas tussen de trays staat. Zodra het medium in alle trays volledig is geëgaliseerd, draait u de meerlaagse kolf op zijn korte zijde met de poorten rechtop. Sluit de klem op de PVC-lijn en verwijder de transferzak door de buisaansluiting te vervangen door de MPC-blauwe sluitdop.OPMERKING: Verwijder het luchtfilter niet, omdat dit gasuitwisseling mogelijk maakt tijdens het uitzetten van de cel. Draai de meerlaagse kolf in de incubatiestand.OPMERKING: Het filter en de slangaansluiting moeten naar boven gericht zijn. Leeg de meerlaagse kolf door deze aan te sluiten op een afzuigfles; Plaats het boven de aspiratorfles en de vloeistof zal eruit stromen.OPMERKING: Kantel de meerlaagse kolf op zijn kant om het gebruikte medium volledig af te tappen door de zwaartekracht. Als alternatief kan het gebruikte medium in een afvalfles worden gegoten met behulp van een aangepaste buisassemblage. Herhaal stap 3.2.5-3.2.11 om het verse medium aan te vullen. Subcultuur van WJ-hMSCs in de meerlaagse kolf (T-175 > 4-laags > 10-laags)Voorwarm celdissociatiereagens (TrypLE) en compleet SFM XF-medium in een incubator van 37 °C voor gebruik. Zuig het gebruikte medium uit de T-175 kolf en gooi weg. Was de celmonolaag met voorverwarmde DPBS, aspiraat en gooi weg. Voeg TrypLE toe aan elke kolf, zorg voor een volledige dekking van de celmonolaag en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C. Breng de suspensie over in een steriele conische buis van 50 ml. Centrifugeer de buis op 100-200 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig de DPBS op en gooi deze weg, en pas op dat u de celpellet niet verstoort. Resuspendeer de celpellet in een minimaal volume (10 ml) voorverwarm compleet SFM XF-medium voor celtelling. Vul een VTN-N-gecoat vierlaags kweekvat met ongeveer 800 ml compleet SFM XF-medium, zoals vermeld in sectie 2 hierboven. Voeg 5.000 cellen/cm2 toe (d.w.z. 1,26 x 107 levensvatbare cellen/kolf). Draai de celsuspensie voorzichtig rond om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Incubeer in een incubator van 37 °C met 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer. Vervang het gebruikte kweekmedium om de 2-3 dagen door vers, voorverwarmd compleet SFM XF-medium voor optimale celgroei totdat de cellen 60% -80% confluentie bereiken of klaar zijn om te worden gesubkweekt in de 10-laagse meerlaagse kolf. Vul een VTN-N-gecoate 10-laags meerlaagse kolf met ongeveer 2 L volledig SFM XF-medium, zoals vermeld in rubriek 2. Voeg 5.000 cellen/cm2 toe (d.w.z. 3,1 x 107 cellen/kolf). Draai de celsuspensie voorzichtig rond om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Incubeer in een incubator van 37 °C met 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer. Vervang het gebruikte kweekmedium om de 2-3 dagen door vers, voorverwarmd compleet SFM XF-medium voor optimale celgroei totdat de cellen 60% -80% confluentie bereiken of klaar zijn om te worden geoogst. 4. Gesloten semi-geautomatiseerde WJ-hMSC dissociatie en oogsten met behulp van gesloten tegenstroom centrifugatie Tegenstroomcentrifugatiekit voor eenmalig gebruikVerbind de kit voor eenmalig gebruik met de pvc-transferzakken voor eenmalig gebruik via buislassen, vergelijkbaar met de configuratie in figuur 1A.OPMERKING: Het standaarddebiet van de kit voor eenmalig gebruik is 30-165 ml/min. Bevestig een 10-laags meerlaagse kolf met confluente WJ-hMSC’s aan de aangepaste buiscombinatie in een bioveiligheidskast. Breng het aangehechte 10-laags kweekvat met de aangepaste buiscombinatie over op een bank en las aan lijn E (3/32 in ID PVC) van de kit voor eenmalig gebruik, zoals weergegeven in figuur 1B. Zorg ervoor dat u een steriele monsterpoort aan lijn G van de high-flow single-use kit las. Sluit vervolgens de oogstlijn H aan op een steriele Luer met een spuit van 50 ml.OPMERKING: Zorg er in alle bovenstaande stappen voor dat de handmatige klemmen gesloten zijn om de vloeistof in elke kitzak vast te zetten. De instrumentrun instellenSchakel het instrument ” AAN” door de tuimelschakelaar aan de achterkant van het instrument in te schakelen. Sluit de laptop aan op de USB-C-poort van het instrument met behulp van de meegeleverde USB-C-kabel (afbeelding 1B). Voer de GUI-software (Counterflow Centrifuge Graphical User Interface) uit vanaf het bureaublad of het startmenu. Nadat u zich hebt aangemeld, laadt u het protocol door op de knop Selecteer een protocol op de welkomsthoofdpagina te klikken.OPMERKING: Het protocol voor het oogsten van tegenstroomcentrifugeren (tabel 1) is gemaakt met behulp van de Protocol Builder-software en lokaal opgeslagen. Druk op de blauwe ontgrendelknop op het instrument en open de glazen deur. Laad de geassembleerde kit voor eenmalig gebruik op het tegenstroomcentrifugeersysteem. Begin met het ophangen van de zakken opgehangen aan hangerhaken in een volgorde die ze het beste uitlijnt met de buispoorten op de bellensensorstrips, met de 10-laagse meerlaagse kolf onder een hoek geplaatst, zoals weergegeven in figuur 1B. Lijn de kit uit met de twee knoppen voor de locatie van de kit, rek de pompslang rond de peristaltische pomp en druk de witte bolvormige connector op zijn plaats.OPMERKING: Zorg ervoor dat de slang over de druksensor correct in de buisbaan is geplaatst. Bevestig de centrifugekamer door de zilveren hendel van de drager van de tegenstroomcentrifugekamer op te tillen en vast te zetten door de hendel rechtop te zetten. Druk de slang van elke poort op de kit in de sporen langs de bellensensorstrips.OPMERKING: Zorg ervoor dat de zakken niet in de knoop raken, zodat het protocolproces gemakkelijk kan worden gevolgd. Sluit de deur door op de deurvergrendeling te drukken.OPMERKING: De pompklemarm sluit, de centrifugekamer draait en de kleppen sluiten. Zonder de deur te sluiten, kan het systeem het protocol niet starten en uitvoeren. Druk op de knop Initiate op de GUI. Er verschijnt een checklist; De eerste vier items zijn instrumentcontroles en de laatste twee items zijn gebruikerscontroles (zorg ervoor dat de tassen en verbindingen overeenkomen met de kitafbeelding en zorg ervoor dat de handmatige klemmen open zijn).OPMERKING: Voor instrumentcontroles worden rode Xs in plaats van blauwe vinkjes weergegeven als er iets niet klopt. Druk op Bevestigen om het scherm met protocolingangen weer te geven. Stel de waarde van het dialoogvenster Gegevensinvoer (Oogstvolume) in op 45 ml en druk op Bevestigen.OPMERKING: Het protocolinvoerscherm wordt gevraagd of er variabele gegevensinvoer is ingesteld in het door de gebruiker gemaakte protocol. Het oogstvolume is in dit protocol ingesteld als een variabele en de gebruiker kan ervoor kiezen om verschillende volumes te testen, afhankelijk van de uiteindelijke celdichtheidsvereisten. Het minimale oogstvolume dat het systeem toestaat is 5 ml. Met het systeem kunnen maximaal vier gegevensvariabelen per protocol worden ingesteld. Het protocol uitvoerenKlik op Initiate (Start) in de GUI en druk op de groene startknop op het instrument om de protocolrun te starten (zie tabel 1).OPMERKING: Het systeem start de stappen volgens het protocol, te beginnen met de priming-volgorde door de lucht in het systeem te vervangen door een buffer. Zodra de priming is voltooid (tabel 1, stap 8) moet u ervoor zorgen dat het gebruikte medium volledig in de afvalzak wordt gepompt.OPMERKING: Zodra de 10-laags meerlaagse kolf leeg is, zal het systeem de gebruiker in de GUI vragen om te bevestigen of het vat leeg is. Druk op de knop “Overslaan” op het instrument als het vat leeg is; zo niet, druk dan op de groene knop “Afspelen/pauzeren” om eventuele restvloeistoffen uit het vat te blijven afvoeren. Zorg er in pauzestappen 15, 19 en 22 (tabel 1) voor dat u de meerlaagse kolf optilt en schudt om de buffer gelijkmatig over alle trays te verdelen. Zodra dit is voltooid, plaatst u de 10-laags meerlaagse kolf terug in de oorspronkelijke trekpositie voor de volgende stappen.OPMERKING: Alleen voor stap 19 in tabel 1 moet u na het schudden de meerlaagse kolf plat plaatsen en gedurende 10-15 minuten bij RT incuberen om de cellen te dissociëren. Zorg er in stap 20 en stap 23 (tabel 1) voor dat de trypsinecellen volledig in de tussenzak worden overgebracht. Meng de tussenzak goed handmatig in stap 25 (tabel 1). Gebruik in stap 26 (tabel 1) een Luer-spuit van 2 ml om door de bemonsteringspoort te monsteren.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste driemaal te bemonsteren voor nauwkeurige celtellingen. Controleer in stap 29 en stap 30 (tabel 1) de stabiele vorming van het gefluïdiseerde celbed; het moet vergelijkbaar zijn met het gefluïdiseerde celbed zoals weergegeven in figuur 1C.OPMERKING: Als het stabiele gefluïdiseerde celbed niet wordt gevormd zoals weergegeven in figuur 1C, is het optimaliseren van de verhouding tussen de g-kracht en de stroomsnelheid (G / F) van cruciaal belang voor het bereiken van een stabiel gefluïdiseerd celbed (hoog celherstel) in de kamer tijdens de cellaad- en wasstappen. De G/F-verhouding is afhankelijk van de grootte van de cellen en de dichtheid van het medium. Een hoge G/F-verhouding is nodig voor een monster-/wasbuffer met hoge dichtheid, terwijl een lage G/F-verhouding kan worden gebruikt voor een monster-/wasbuffer met lage dichtheid. De run is voltooid bij de stap Ramp to Stop (stap 35 in tabel 1) en alle knijpwaarden op het tegenstroomcentrifugatiesysteem worden automatisch gesloten.OPMERKING: Zorg er ten slotte voor dat de handmatige klemmen gesloten zijn om de vloeistof in elke kitzak vast te zetten voordat u de deur opent. Nadat het protocol is uitgevoerd, drukt u op de blauwe ontgrendelknop op het instrument en opent u de glazen deur. Haal de kit voor eenmalig gebruik met het geoogste concentraat uit het instrument. Sluit de oogstlijn aseptisch af met een handdraagbuissealer. Breng de verzegelde spuit gevuld met de geconcentreerde celoogst voorzichtig over in de biologische veiligheidskast voor celtelling en cryopreservatie. Maak de kamer opnieuw los met behulp van de hendel, trek de lampconnector uit de fitting en til de kit voorzichtig weg en gooi deze in een biohazard-zak. Reinig het instrument met ethanoldoekjes en zorg ervoor dat u de deur sluit. Sluit eerst de GUI-toepassing voordat u de schakelaar aan de achterkant van het instrument uitschakelt.OPMERKING: Het celoogstprotocol werd getest in biologische drievouden (n = 3). 5. Beoordeling van kritische kwaliteitskenmerken (CQA) Celidentiteitsoppervlakmarkers (CD73, CD90 en CD105) en niet-stromale markers (CD34 en CD45)Verdun de geoogste WJ-hMSC-celsuspensie tot een concentratie van 1 x 106 levensvatbare cellen/ml door een geschikt volume flowcytometriebuffer (DPBS met 1% BSA of 2% FBS) toe te voegen. Voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan elke microcentrifugebuis of 96-putplaat. Zorg ervoor dat er minimaal 0,1 x 106 cellen aanwezig zijn per 100 μL celsuspensie. Voeg fluorofoor-geconjugeerd antilichaam toe aan het monster in een geschikte verdunning, zoals aanbevolen door de leverancier van antilichamen. Incubeer gedurende 20 minuten in het donker. Voeg na de incubatie 100 μL flowcytometriebuffer toe om de monsters te wassen door centrifugeren op 380 x g gedurende 3 minuten. Gooi het supernatant weg en laat de pellet achter. Resuspendie van de celpellet in 200 μL flowcytometriebuffer en onderworpen aan flowcytometrieanalyse30. Kolonievormende eenheden fibroblastische assay (CFU-F)Verdun de celsuspensie tot een concentratie van 1.000 levensvatbare cellen/ml volledig kweekmedium. Plaat ~500 cellen per put in een 6-well weefselkweekplaat in compleet kweekmedium. Incubeer gedurende 10-14 dagen bij 37 °C in 5% bevochtigd CO2, was met PBS en kleurt met 0,5% kristalviolet in methanol gedurende 30 minuten bij RT. Som de kolonies in elke put op. Bereken de CFU-F-efficiëntie: Deel het aantal gevormde kolonies door het oorspronkelijke zaaigetal om de procentuele efficiëntie van kolonievorming te verkrijgen en druk deze uit als een percentage. Trilineage differentiatie potentiaalZaad 5 x 103 cellen/cm2 in osteogenese en adipogenese differentiatiemedium in 12-well platen volgens het protocol van de fabrikant. Bereid voor chondrogenese 1,6 x 107 levensvatbare cellen / ml voor en genereer micromassaculturen door 5 μL-druppels van de celoplossing in de centra van de putten van 96-putplaten te zaaien, volgens het protocol van de fabrikant. Maak tijdens de differentiatie elke 3-4 dagen volledige mediumveranderingen. Controleer na 14 dagen (voor adipogenese) of 21 dagen (voor osteogenese en chondrogenese) de culturen op differentiatie door afstammingsspecifieke biologische vlekken te gebruiken volgens het protocol van de fabrikant. Voor adipogene differentiatie, kleuring de culturen met 0,5% Oil Red O-oplossing. Voer voor osteogenese kleuring uit met behulp van een 2% Alizarin Red S-oplossing. Voor chondrogene differentiatie kleurt u de micromassapellets met 1% Alcian Blue. Cytokine secretie profielenOntdooi de gecryopreserveerde cellen die handmatig of met behulp van het tegenstroomcentrifugatiesysteem zijn geoogst en zaai 5.000 cellen / cm2 in een T-175-kolf met SFM XF-media. Verzamel na 4 dagen het gebruikte kweekmedium en bewaar het bij −80 °C tot de analyse. Kwantificeer de expressie van cytokines met behulp van een cytokine-expressieprofielen 19-plex paneelkit op een multiplexlezer. Voer de multiplex immunoassays uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Representative Results

De WJ-hMSC master cell bank (MCB) na het ontdooien werd gedurende drie opeenvolgende passages (p1-p4) in klassiek serumbevattend medium gehandhaafd om voldoende werkende celbanken (WCB’s) te produceren voor de experimenten. De p4 WCB’s werden ontdooid en uitgebreid in zowel serumhoudend medium als SFM XF-medium voor nog drie passages (p4-p7) in T-175-kolven. De WJ-MSC’s pasten zich goed aan wanneer ze werden geëxpandeerd in SFM XF-medium en waren in staat om een stabiele proliferatie te behouden die vergelijkbaar is met die in serumbevattend medium (figuur 2A). De cellen die in SFM XF-medium werden uitgebreid, vertoonden echter een iets langere fibroblastachtige spilvormige morfologie, wat resulteerde in een iets grotere celgrootte (figuur 2B) van gemiddeld ~ 17 μm in vergelijking met ~ 15 μm in serumbevattend medium. In beide mediumomstandigheden over de drie passages bereikten de WJ-hMSCs consequent hun maximale celdichtheid van ~2,3 x 104 cellen/cm2 en een populatieverdubbelingstijd van ~34 uur (figuur 2C,D). Voor grootschalige WJ-hMSC-expansie in een gesloten systeem voerden we eerst een zaadtreinuitbreiding van WJ-hMSCs uit in een 4-laagse kolf en vervolgens in een 10-laagse meerlaagse kolf. Bij ongeveer 80%-90% samenvloeiing na 4 dagen kweek, oogstten we 9,6 x 10 7 ± 0,9 x 107 en 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 cellen voor respectievelijk de 4-laagse en 10-laagse stapels. Een hogere celdichtheid van 3,6 x 10 4-3,8 x 104 cellen / cm 2 werd bereikt in vergelijking met in de T-175-kolven, wat betekent dat de stapels een betere celexpansie tot zevenvoudig mogelijk maakten. Verder werden de WJ-hMSCs uitgebreid in 10-laags kweekvaten direct geoogst met behulp van tegenstroomcentrifugatie. De steriele verbinding met de kit voor eenmalig gebruik was eenvoudig tot stand te brengen voor directe vloeistofoverdracht met een maximaal debiet van 165 ml / min met behulp van de peristaltische pomp van het instrument. Het semi-geautomatiseerde celoogstproces werd bereikt door eerst de cellen te oogsten met behulp van enzymatische dissociatie, de cellen in de tegenstroomkamer te laden voor volumereductie en concentratie, en vervolgens te wassen met wasbuffer, die ongeveer 3x het volume van de tegenstroomcentrifugeerkamer was. Verder werden de gewassen cellen vervolgens geconcentreerd en geoogst tot het gewenste oogstvolume dat vooraf in het protocol was ingesteld. De verwerkingsstappen die worden gebruikt voor de semi-geautomatiseerde celverwerking zijn ontworpen om de handmatige oogstworkflow te emuleren. We bereikten een 10-voudige volumereductie, wat resulteerde in het genereren van celconcentraties tot 5,3 miljoen cellen / ml. Het protocol was in staat om een hoog celherstel te bereiken bij ~ 98% en een hoge levensvatbaarheid van de cel bij ~ 99% consistent voor alle drie de onafhankelijke runs (figuur 3A-C). We hebben uitgebreide celkarakteriseringstests uitgevoerd om de kritische kwaliteitskenmerken van de celoogst te bepalen met behulp van tegenstroomcentrifugatie in vergelijking met handmatige centrifugatie. Om de identiteit van de WJ-hMSCs te testen, werden celoppervlakmarkers geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. Zoals weergegeven in figuur 4A, vertoonden de WJ-hMSCs die met beide methoden werden geoogst karakteristieke oppervlaktemarkeringsprofielen volgens de ISCT-voorschriften, positieve expressie van CD73, CD90 en CD105, evenals negatieve expressie van CD34 en CD45. Om vervolgens het clonogene potentieel van de WJ-hMSCs te evalueren, werden CFU-F-assays uitgevoerd. Zoals weergegeven in figuur 4B, vertoonden cellen geoogst uit tegenstroomcentrifugatie een vergelijkbaar CFU-F-potentiaal in vergelijking met cellen geoogst door handmatige centrifugatie (respectievelijk 21% ± 1% versus 20% ± 1%). Bovendien, zoals weergegeven in figuur 4C, behielden de post-tegenstroom centrifugatie-geoogste cellen het vermogen om te differentiëren in adipocyten, osteoblasten en chondrocyten vergelijkbaar met de cellen in de handmatige centrifugatiemethode. Ten slotte onderzochten we 18 verschillende cytokinesecretieprofielen van de cellen met behulp van multiplex immunoassays. Zoals te zien is in figuur 4D, handhaafden de cellen die werden gewassen en geconcentreerd met behulp van de post-tegenstroomcentrifugatie cytokinesecretieprofielen en waren de profielen vergelijkbaar met die van het monster dat werd genomen vóór het wassen / concentreren van de cellen (pre-tegenstroomcentrifugatie). Over het algemeen hebben we een efficiënte hMSC-expansie aangetoond in een SFM XF-kweeksysteem, en de cellen gewassen en geconcentreerd met behulp van het gesloten, geautomatiseerde tegenstroomcentrifugatiesysteem leverden een hoog celherstel en levensvatbaarheid na het wassen op en konden hun fenotype en functionaliteit behouden. Het gesloten semi-geautomatiseerde proces dat in deze studie is ontwikkeld, kan consistentie van de productkwaliteit leveren in termen van uiteindelijke WJ-MSC-terugwinning, zoals blijkt uit drie onafhankelijke runs. Figuur 1: High-flow single-use kit configuratie en assemblage voor de oogst, het wassen en de concentratie van hMSCs . (A) Kitdiagram nadat de zakken zijn aangesloten in lijn met de respectieve buizen. (B) De 10-laagse meerlaagse kolf die is aangesloten op de high-flow single-use kit met de aangepaste buiscombinatie. (C) Visualisatie van het stabiele gefluïdiseerde celbed gevormd in de tegenstroomkamer via de camerafunctie die is ingeschakeld in de grafische gebruikersinterface van de tegenstroomcentrifugatiesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Vergelijking van de celmorfologie en expansie van hMSCs in serumbevattend medium en SFM XF-medium. (A) De representatieve celmorfologie van hMSCs in klassiek serummedium en SFM XF-medium. De SFM XF-geëxpandeerde cellen vertoonden een langere, spindelvormige, karakteristieke fibroblastachtige morfologie, terwijl de cellen gekweekt in serumbevattend medium een meer afgeplatte morfologie vertoonden. (B) De gemiddelde MSC-grootte tussen het serumbevattende medium en het SFM XF-medium, gemeten met een geautomatiseerde celteller (n = 3). Het is duidelijk te zien dat de SFM XF-geëxpandeerde cellen over het algemeen groter waren dan serum-geëxpandeerde cellen over verschillende passages. De totale celopbrengst in verschillende passages (n= 3) (C) in termen van cellen per kweekoppervlak en (D) populatieverdubbelingsniveaus. Vergelijkbare niveaus van celopbrengst werden verkregen tussen het SFM XF-medium en serumbevattend medium over verschillende passages. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± de standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Karakterisering van cellen die zijn verwerkt met behulp van het tegenstroomcentrifugatiesysteem . (A) Totaal levensvatbare cellen voor en na het wassen en de concentratie. (B) Een volumereductie van 10x werd bereikt na de centrifugatieverwerking van de tegenstroom. (C) Volledig herstel en levensvatbaarheid van de cellen. De gegevens worden gemiddeld over drie biologische replicaties (n = 3) van was- en concentratieruns. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Analyse van kritische kwaliteitskenmerken . (A) Representatieve gegevens van flowcytometrie. (B) Representatieve beelden van de totale KVE. (C) Representatieve microscopische beelden van de trilineagedifferentiatie. (D) Resultaten van de cytokine-expressieanalyse voor en na de verwerking van de cellen op het tegenstroomcentrifugatiesysteem (n = 3). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Volgorde van de hMSC-oogst door trypsinisatie, wassen en concentratieprotocol op het tegenstroomcentrifugatiesysteem, inclusief de eerste primingstappen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

In dit werk hebben we de mogelijkheid getoond om hMSC-dissociatie te sluiten en semi-automatiseren en op de bank te wassen en te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatie-instrument. Een van de kritieke stappen in de hele workflow is ervoor te zorgen dat de buizen zijn aangesloten volgens het vooraf ingestelde protocol dat is gedefinieerd in de protocolbouwer van het tegenstroomcentrifugatiesysteem. De installatie en bediening zijn eenvoudig en de tijd die nodig was om ongeveer 2 L cultuur van een 10-laags kolf van kitassemblage tot celoogst te verwerken, was ongeveer 60 minuten. Een van de beperkende stappen in deze workflow is de vloeistofoverdracht van de meerlaagse kolf naar de transferzakken die zijn aangesloten op het tegenstroomcentrifugatie-instrument. De high-flow single-use kit kan alleen worden uitgevoerd met een maximaal debiet van 165 ml / min, en dit kan een uitdaging zijn voor het verwerken van bijvoorbeeld een 40-laags kolf. Om het proces van vloeistofoverdracht te versnellen, kunnen externe pompen met een hoog debiet worden gebruikt om de trypsine-inhoud eerst in een transferzak over te brengen, gevolgd door het wassen / concentreren en oogsten van de cellen uit de transferzak met behulp van het tegenstroomcentrifugatiesysteem. Bovendien kan dit protocol ook worden toegepast voor passerende cellen van 4-laags tot 10-laags meerlaagse kolven. Verder stroomopwaarts kan het tegenstroomcentrifugatiesysteem ook worden geoptimaliseerd voor het wassen van ontdooide hMSC’s en directe oogst en mediumformulering in meerlaagse kolven om de zaadtrein te starten. Opgemerkt moet worden dat het minimale aantal cellen dat nodig is om het wervelbed in de tegenstroomcentrifugeerkamer te vormen ongeveer 30 miljoen cellen is en dat het maximale aanbevolen volume om per batch te verwerken 20 l is.

Momenteel zijn de bevestiging van de aangepaste buisassemblage aan de meerlaagse kolf in de bioveiligheidskast en het autoclaveren van de delen van de componenten niet wenselijk in een cGMP-omgeving. Als alternatief kan een aangepaste gamma-gesteriliseerde buisassemblage worden uitbesteed aan leveranciers. Leveranciers die meerlaagse kolven leveren, bieden ook de mogelijkheid om de kolven vooraf te voorzien van gewenste buisassemblages, inclusief een filter van 0,2 μm, en gammasterilisatie van de hele outfit. Dit zou ervoor zorgen dat de meerlaagse kolven en de bevestigde buizen echt gesloten zijn, wat betekent dat het proces op de bank in een klasse C cleanroom-omgeving kan worden voltooid.

Dit proces met behulp van het tegenstroomcentrifugatiesysteem is niet beperkt tot op adherent gebaseerde gekweekte cellen in een meerlagig vat en kan worden aangepast aan dynamische (geroerde tank of golfbioreactoren) en statische (gasdoorlatende) op suspensie gebaseerde celexpansieplatforms. Specifiek voor hMSC’s die zijn uitgebreid in 3D-microdragerculturen, kunnen protocollen worden geoptimaliseerd op het tegenstroomcentrifugatiesysteem om de hMSC’s die zijn losgekoppeld van microdragers te oogsten, te wassen en te formuleren.

Over het algemeen heeft de toenemende interesse in het ontwikkelen van translationele cellulaire therapieën met verbeterde procesrobuustheid en betrouwbaarheid geleid tot de ontwikkeling van gesloten, geautomatiseerde celverwerkingsplatforms. Deze systemen zijn absoluut noodzakelijk, omdat ze het aantal handelingsstappen verminderen, mogelijke besmetting door steriele verbindingen voorkomen en de productiekosten verlagen door arbeid te verminderen en het effectieve gebruik van cleanroomruimte^{te verbeteren 21}. In lijn hiermee zijn veel van de productontwikkelaars voor celtherapie die wettelijke goedkeuring zoeken om hun therapieën te vertalen, zich bewust van het belang van het sluiten van het proces en het implementeren van volledige automatisering of semi-automatisering al in de procesontwikkelingsfase 14,31,32.

Met het gebruik van regelgevingsvriendelijk SFM XF-medium en samen met aanvullende reagentia die voldoen aan 21 CFR GMP Part 11 en internationale kwaliteitsrichtlijnen, zou dit semi-geautomatiseerde proces gemakkelijk geschikt zijn voor klinische productie. We hebben de reproduceerbaarheid van het gesloten proces en het behoud van de kwaliteit van de WJ-MSC’s aangetoond. Het verbeteren van de efficiëntie en veiligheid van het kweken van op aanhang gebaseerde cellen in meerlaagse kolven zou niet alleen het hMSC-therapieveld ten goede komen, maar ook bedrijven in cellijnbankieren en de productie van adherente virussen.

Materials

2L PVC transfer bag	TerumoBCT	BB*B200TM
Alcian blue solution, pH 2.5	Merck	101647
Alizarin-Red Staining Solution	Merck	TMS-008-C
APC anti-human CD73 Antibody	Biolegend	344015
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	Bio-Rad
Counterflow Centrifugation System	Thermo Fisher Scientific	A47679	Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System
Crystal Violet	Sigma-aldrich	C0775
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	A1286001
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	A1285601	no calcium, no magnesium
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N)	Thermo Fisher Scientific	A27940
CTS TrypLE Select Enzyme	Thermo Fisher Scientific	A1285901
Custom tubing assembly	Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC)	N/A	Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet
Emflon II capsule (0.2um filter)	Pall	KM5V002P2G100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12662029	Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions
FGF-basic	Thermo Fisher Scientific	PHG0024
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323203
FITC anti-human CD45 Antibody	Biolegend	304005
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328107
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400109
Hi-Flow Single Use Kit	Thermo Fisher Scientific	A46575	Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min
Multi-layered systems	Thermo Fisher Scientific	140360 (4-layers); 140410 (10-layers)	Nunc Standard Cell Factory Systems
NucleoCounter NC-3000	Chemometec	NC-3000
Oil red O staining solution	Merck	102419
PDGF-BB	Thermo Fisher Scientific	PHG0045
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
PerCP anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343519
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400147
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays	Thermo Fisher Scientific		Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A
Sample port	Thermo Fisher Scientific	A50111	Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher Scientific	A10070-01
StemPro Chondrocyte Differentiation	Thermo Fisher Scientific	A10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)	Thermo Fisher Scientific	ME20236L1	Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher Scientific	A10072-01
T175 Nunc EasYFlask	Thermo Fisher Scientific	159910
T75 Nunc EasYFlask	Thermo Fisher Scientific	156472
TGFβ1	Thermo Fisher Scientific	PHG9204
WJ MSCs	PromoCell	(#C12971; Germany)	Human mesenchymal stem cells
αMEM media	Thermo Fisher Scientific	12571063	With nucleosides