Évaluation des activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées in vitro
Summary
Nous introduisons quatre méthodes pour évaluer les activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées à l’aide de techniques in vitro . Ces méthodes peuvent être adaptées pour étudier les interactions de différentes nanoparticules et surfaces nanostructurées avec un large éventail d’espèces microbiennes.
Abstract
Les activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées, telles que l’argent, l’oxyde de zinc, le dioxyde de titane et l’oxyde de magnésium, ont déjà été explorées dans des contextes cliniques et environnementaux et dans des produits alimentaires consommables. Cependant, un manque de cohérence dans les méthodes expérimentales et les matériaux utilisés a abouti à des résultats contradictoires, même entre les études des mêmes types de nanostructures et espèces bactériennes. Pour les chercheurs qui souhaitent utiliser des nanostructures comme additif ou revêtement dans la conception d’un produit, ces données contradictoires limitent leur utilisation en milieu clinique.
Pour faire face à ce dilemme, dans cet article, nous présentons quatre méthodes différentes pour déterminer les activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées, et discutons de leur applicabilité dans différents scénarios. L’adaptation de méthodes cohérentes devrait conduire à des données reproductibles qui peuvent être comparées entre les études et mises en œuvre pour différents types de nanostructures et espèces microbiennes. Nous introduisons deux méthodes pour déterminer les activités antimicrobiennes des nanoparticules et deux méthodes pour les activités antimicrobiennes des surfaces nanostructurées.
Pour les nanoparticules, la méthode de coculture directe peut être utilisée pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices et bactéricides minimales des nanoparticules, et la méthode de culture en exposition directe peut être utilisée pour évaluer en temps réel l’activité bactériostatique par rapport à l’activité bactéricide résultant de l’exposition aux nanoparticules. Pour les surfaces nanostructurées, la méthode de culture directe est utilisée pour déterminer la viabilité des bactéries indirectement et directement en contact avec des surfaces nanostructurées, et la méthode d’exposition par contact focalisé est utilisée pour examiner l’activité antimicrobienne sur une zone spécifique d’une surface nanostructurée. Nous discutons des variables expérimentales clés à prendre en compte pour la conception d’études in vitro lors de la détermination des propriétés antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées. Toutes ces méthodes sont relativement peu coûteuses, utilisent des techniques relativement faciles à maîtriser et reproductibles pour plus de cohérence, et sont applicables à un large éventail de types de nanostructures et d’espèces microbiennes.
Introduction
Rien qu’aux États-Unis, 1,7 million de personnes développent une infection nosocomiale (IAS) chaque année, une infection sur 17 entraînant la mort1. De plus, on estime que les coûts de traitement des IASS varient de 28 milliards de dollars à 45 milliards de dollars par année 1,2. Ces IAS sont prédominées par Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)3,4 et Pseudomonas aeruginosa4, qui sont généralement isolés des infections chroniques des plaies et nécessitent généralement un traitement intensif et du temps pour produire un résultat favorable pour le patient.
Au cours des dernières décennies, plusieurs classes d’antibiotiques ont été développées pour traiter les infections liées à ces bactéries et à d’autres bactéries pathogènes. Par exemple, des analogues de la rifamycine ont été utilisés pour traiter le SARM, d’autres infections à Gram positif et à Gram négatif, et les infections à Mycobacterium spp.5. Dans les années 1990, pour traiter efficacement un nombre croissant d’infections à M. tuberculosis, des médicaments supplémentaires ont été combinés avec des analogues de rifamycine pour augmenter leur efficacité. Cependant, environ 5 % des cas de M. tuberculosis demeurent résistants àla rifampicine5,6, et on s’inquiète de plus en plus des bactéries multirésistantes7. Actuellement, l’utilisation d’antibiotiques seuls peut ne pas être suffisante dans le traitement des IASS, ce qui a provoqué une recherche continue de thérapies antimicrobiennes alternatives1.
Les métaux lourds, tels que l’argent (Ag)8,9,10 et l’or (Au)11, et les céramiques, telles que le dioxyde de titane (TiO 2)12 et l’oxyde de zinc (ZnO)13, sous forme de nanoparticules (NP) (AgNP, AuNP, TiO2 NP et ZnONP, respectivement) ont été examinés pour leurs activités antimicrobiennes et ont été identifiés comme des alternatives antibiotiques potentielles. En outre, les matériaux biorésorbables, tels que les alliages de magnésium (alliages Mg)14,15,16, les nanoparticules d’oxyde de magnésium 17,18,19,20,21 et les nanoparticules d’hydroxyde de magnésium [nMgO et nMg(OH)2, respectivement]22,23,24, ont également été examinés. Cependant, les études antimicrobiennes antérieures sur les nanoparticules utilisaient des matériaux et des méthodes de recherche incohérents, ce qui a donné lieu à des données difficiles ou impossibles à comparer et parfois contradictoirespar nature 18,19. Par exemple, la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration bactéricide minimale (MBC) des nanoparticules d’argent variaient considérablement selon les études. Ipe et coll.25 ont évalué les activités antibactériennes des AgNP avec une taille moyenne de particules de ~26 nm afin de déterminer les CMI contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Les CMI identifiées pour P. aeruginosa, E. coli, S. aureus et SARM étaient de 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL et 10 μg/mL, respectivement. En revanche, Parvekar et coll.26 ont évalué les PN Agn avec une taille moyenne des particules de 5 nm. Dans ce cas, la CMI AgNP et une CMM de 0,625 mg/mL se sont révélées efficaces contre S. aureus. De plus, Loo et al.27 ont évalué les AgNP d’une taille de 4,06 nm. Lorsque E. coli a été exposé à ces nanoparticules, le CMI et le MBC ont été signalés à 7,8 μg/mL. Enfin, Ali et coll.28 ont étudié les propriétés antibactériennes des AgNP sphériques d’une taille moyenne de 18 nm. Lorsque P. aeruginosa, E. coli et SARM ont été exposés à ces nanoparticules, la CMI a été identifiée à 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL et 36 μg/mL, respectivement, et le MBC a été identifié à 36 μg/mL, 42 μg/mL et 30 μg/mL, respectivement.
Bien que l’activité antibactérienne des nanoparticules ait été largement étudiée et rapportée au cours des dernières décennies, il n’existe pas de norme pour les matériaux et les méthodes de recherche utilisés pour permettre des comparaisons directes entre les études. Pour cette raison, nous présentons deux méthodes, la méthode de co-culture directe (méthode A) et la méthode d’exposition directe (méthode B), pour caractériser et comparer les activités antimicrobiennes des nanoparticules tout en maintenant la cohérence des matériaux et des méthodes.
En plus des nanoparticules, les surfaces nanostructurées ont également été examinées pour leurs activités antibactériennes. Il s’agit notamment de matériaux à base de carbone, tels que les nanofeuilles de graphène, les nanotubes de carbone et le graphite29, ainsi que les alliages Mg et Mg purs. Chacun de ces matériaux a présenté au moins un mécanisme antibactérien, y compris des dommages physiques imposés aux membranes cellulaires par des matériaux à base de carbone et des dommages aux processus métaboliques ou à l’ADN par la libération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) lorsque le Mg se dégrade. De plus, lorsque le zinc (Zn) et le calcium (Ca) sont combinés dans la formation d’alliages Mg, le raffinement de la taille des grains de la matrice Mg est amélioré, ce qui entraîne une réduction de l’adhérence bactérienne aux surfaces du substrat par rapport aux échantillons de Mg seuls14. Pour démontrer l’activité antibactérienne, nous présentons la méthode de culture directe (méthode C), qui détermine l’adhésion bactérienne sur et autour des matériaux nanostructurés au fil du temps grâce à la quantification des unités bactériennes formant colonies (UFC) avec contact direct et indirect avec la surface.
La géométrie des nanostructures sur les surfaces, y compris la taille, la forme et l’orientation, pourrait influencer les activités bactéricides des matériaux. Par exemple, Lin et coll.16 ont fabriqué différentes couches nanostructurées de MgO à la surface de substrats de Mg par anodisation et dépôt électrophorétique (EPD). Après une période d’exposition à la surface nanostructurée in vitro, la croissance de S. aureus a été considérablement réduite par rapport au Mg non traité. Cela indiquait une plus grande puissance de la surface nanostructurée contre l’adhésion bactérienne par rapport à la surface métallique Mg non traitée. Pour révéler les différents mécanismes des propriétés antibactériennes de diverses surfaces nanostructurées, une méthode d’exposition par contact focalisé (méthode D) qui détermine les interactions cellule-surface dans la zone d’intérêt est discutée dans cet article.
L’objectif de cet article est de présenter quatre méthodes in vitro applicables à différentes nanoparticules, surfaces nanostructurées et espèces microbiennes. Nous discutons des considérations clés pour chaque méthode afin de produire des données cohérentes et reproductibles à des fins de comparabilité. Plus précisément, la méthode de coculture directe17 et la méthode d’exposition directe sont utilisées pour examiner les propriétés antimicrobiennes des nanoparticules. Grâce à la méthode de coculture directe, les concentrations minimales inhibitrices et bactéricides minimales (CMI et MBC90-99,99, respectivement) peuvent être déterminées pour les espèces individuelles, et la concentration la plus puissante (CMP) peut être déterminée pour plusieurs espèces. Grâce à la méthode d’exposition directe, les effets bactériostatiques ou bactéricides des nanoparticules à des concentrations minimales inhibitrices peuvent être caractérisés par des lectures de densité optique en temps réel au fil du temps. La méthode de culture directe14 convient à l’examen direct et indirect des bactéries en contact direct et indirect avec des surfaces nanostructurées. Enfin, la méthode d’exposition par contact focalisé16 est présentée pour examiner l’activité antibactérienne d’une zone spécifique sur une surface nanostructurée par l’application directe de bactéries et la caractérisation de la croissance bactérienne à l’interface cellule-nanostructure. Cette méthode est modifiée à partir de la norme industrielle japonaise JIS Z 2801:200016 et vise à se concentrer sur les interactions microbes-surface et à exclure les effets de la dégradation de l’échantillon en vrac en culture microbienne sur les activités antimicrobiennes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté quatre méthodes in vitro (A-D) pour caractériser les activités antibactériennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées. Bien que chacune de ces méthodes quantifie la croissance et la viabilité bactériennes au fil du temps en réponse aux nanomatériaux, il existe une certaine variation dans les méthodes utilisées pour mesurer la densité, la croissance et la viabilité initiales de l’ensemencement bactérien au fil du temps. Trois de ces méthodes, la méthode de coc…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs apprécient le soutien financier de la National Science Foundation des États-Unis (NSF CBET award 1512764 et NSF PIRE 1545852), des National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de la bourse de développement du corps professoral Regents de l’Université de Californie (UC), de la subvention de démarrage du Committee on Research (Huinan Liu) et de la subvention du programme de mentorat en recherche d’études supérieures UC-Riverside accordée à Patricia Holt-Torres. Les auteurs apprécient l’aide fournie par le Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) de l’UC-Riverside pour l’utilisation du SEM/EDS et le Dr Perry Cheung pour l’utilisation de la XRD. Les auteurs tiennent également à remercier Morgan Elizabeth Nator et Samhitha Tumkur pour leur aide dans les expériences et les analyses de données. Les opinions, résultats, conclusions ou recommandations exprimés dans cet article sont ceux des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation ou des National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
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